内毒素光度测定法检查技术-文档资料

1、Page 1光度测定法光度测定法BET检查技术检查技术湛江安度斯生物有限公司2009年3月2022-3-7Page 21、光度测定法方法学分类2、光度测定法原理3、动态比浊法BET4、终点比色法BET2022-3-7Page 31、光度测定法方法学分类光度测定法（定量法检测）浊度法显色法动态浊度法终点浊度法动态显色法终点显色法(比浊法)(比色法)2022-3-7Page 42、光度测定法原理光电转换原理 光度测定法是利用鲎试剂与内毒素的混合物在反应过程的透光度变化与内毒素浓度的关系来定量检测内毒素的一种方法。 当一束光线进入如下光电转换装置时，该装置将产生电流I，我们称I为透光强度。入射光入射

2、光反应混合物反应混合物透射光透射光光电池光电池I透光容器透光容器2022-3-7Page 5设：初始时的透光强度为Is，某时刻的透光强度为It定义1：透光度（Rt）： Rt=It/Is(%) 初始时It=Is，Rt=100%，Rt曲线变化趋势是由高至低。 定义2： 吸光度(OD)： OD= -lg(It/Is) 初始时It=Is，OD=0，OD曲线变化趋势是由低至升高。选择不同的参数(Rt或OD)将得到不同变化趋势的动态曲线。T(分分)IsItIeI2022-3-7Page 6TAL与内毒素反应的动态曲线(Rt-T曲线)以透光度（Rt）为纵座标，时间（T）为横座标，把TAL与内毒素反应引起反应

3、混合液透光度的变化连续地描绘在座标系中，便得到该反应的动态曲线如图：Rt（%）T（分）（分）动态曲线动态曲线100孕育期孕育期反应期反应期结束结束2022-3-7Page 7TAL与内毒素反应的动态曲线(OD-T曲线)以吸光度（OD）为纵座标，时间（T）为横座标，把TAL与内毒素反应引起反应混合液吸光度的变化连续地描绘在座标系中，便得到该反应的动态曲线如图：ODT（分）（分）动态曲线0孕育期孕育期反应期反应期结束结束2022-3-7Page 8动态曲线的特点把标准内毒素制备成三个浓度C1、C2、C3（ C1C2C3 ），分别与TAL反应，描绘出反应的动态曲线如下图：C3Rt（%）T（分）（分）

4、C2C1分析动态曲线可看出：内毒素浓度越高，孕育期越短；内毒素浓度越高，反应期曲线越陡；1.内毒素浓度越高，进入结束期越快。2022-3-7Page 9光度测定法BET试验的相关变量C3100Rt（%）T（分）（分）C2C1相关变量： 内毒素浓度(C) 透光度(Rt或OD) 反应时间(T)2022-3-7Page 101）动态法原理固定透光度(Rt)，建立内毒素浓度与反应时间关系的标准曲线（C-T曲线），用供试品的反应时间比对标准曲线，得出供试品的内毒素浓度。这里的反应时间是指反应混合液的透光度到达预设透光度值（Rt）的时间。回归分析回归分析Rt%预设透光度值预设透光度值R0T1T2T3921

5、00T(分分)C1C2C3LgT=b-kLgCLgTT3T2T1C3C2C1LgC（1）建立标准曲线2022-3-7Page 11（2）测定样品内毒素浓度（Cs）用鲎试剂与未知内毒素含量的供试品(S)反应，得到反应时间Ts，比对C-T关系的标准曲线，可得出供试品的内毒素含量Cs。比对标准曲线比对标准曲线TsT(分分)Rt(%)R0CsLgT=b-kLgCLgCCsTsLgT922022-3-7Page 122）终点法原理固定反应时间（T），建立内毒素浓度与透光度关系的标准曲线（C-Rt曲线），用供试品的透光度比对标准曲线，得出供试品的内毒素浓度。Rt(%)T(分分)C1C2C3100R1R2R

6、3预设反应终止时间预设反应终止时间T0RtR3R2R1C3C2C1Rt=b-KC回归分析回归分析（1）建立标准曲线2022-3-7Page 13（2）测定样品内毒素浓度（Cx）用鲎试剂与未知内毒素含量的供试品（X）反应，得到透光度值Rx，比对C-Rt关系的标准曲线，可得出供试品的内毒素含量Cx。CxToT(分分)Rx100Rt(%)Rt(%)Rt=b-KCRxCx比对标准曲线比对标准曲线2022-3-7Page 143、动态比浊法试验仪器及器具 动态微孔平板仪或试管仪 BET软件 微孔平板、反应试管等2022-3-7Page 15英国Lab Kinetics公司ATi动态试管仪, 96孔湛江安

7、度斯公司开发的BET专用软件“生物探针-2002” 2022-3-7Page 16美国Charles River Endosafe 便携式检测系统（PTS）美国 BioTek公司超级酶标仪，ELx808IU,使用96孔微孔板2022-3-7Page 17LKM细菌内毒素动态试管仪 制造商：英国莱伯金耐特公司（Lab Kinetics Ltd.） 世界上第一台动态试管仪的生产商 目前世界上销量最大的动态试管仪 已经取得医疗器械许可证 完善的售后服务1、体积小巧，占用空间小；、体积小巧，占用空间小；2、恒温性能、光学性能精密，、恒温性能、光学性能精密， 各孔温度均在各孔温度均在370.2， 这是国

8、内同类仪器无法达这是国内同类仪器无法达 到的。到的。3、配有专业的、操作简单的软、配有专业的、操作简单的软 件系统。件系统。2022-3-7Page 18ELx808IU型动态酶标仪 制造商：美国伯腾公司（BioTek） 功能强大的细菌内毒素检测仪器 丰富的面板操作及数据分析，无需电脑可独立操作 可使用多个波长同时分析2022-3-7Page 19动态比浊法试验程序1、器具的准备2、验证试验 标准曲线的可靠性试验 干扰试验3、检查法2022-3-7Page 201）试验器具的准备器具分类器具分类器具名称器具名称反应试管玻璃试管（外径875mm或1075mm）稀释容器大口径玻璃试管移液器具刻度吸

9、管及洗耳球，或移液器及无热原吸头等其他试管架、酒精灯、异丙醇浸泡的无纺布、镊子、剪刀、砂轮、封口膜或医用胶布、标记纸等凡是与供试品或反应试剂接触的器具，必须经除热原处理。通常玻璃器具需经250 、60分钟的干烤处理2022-3-7Page 212）标准曲线的可靠性试验试验目的 验证实验室的条件是否满足BET试验的要求 验证实验人员的实验技能是否满足BET试验的要求 验证实验所用试剂（包括鲎试剂、内毒素标准品、BET水等）是否满足BET试验要求Page 221、试剂2022-3-7Http:/Page 22试剂名称试剂名称厂家厂家装量装量规格规格动态浊度法TAL安度斯1.25ml/支10EU/m

10、l0.03EU/ml内毒素标准品（CSE）安度斯10ng/支10EU/ng（CoA）BET水（W）安度斯25ml/瓶内毒素0.003EU/ml2022-3-7Page 232、反应项目将标准内毒素制备成至少3个浓度的稀释液，相邻浓度间稀释倍数不得大于10，最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限实验前，先预热动态仪，使其达到反应温度项 目平行管阴性对照溶液(D)O OO O OO O OO O O内毒素标准溶液（C）(EU/mL)0.030.252.02022-3-7Page 243、溶液C的制备E1003.6ml WE100.4ml3.2ml WE20.8ml2.8ml WE0.250.4ml

11、2.8ml WE0.030.4ml30s0.4ml30s0.4ml30s0.8ml 30s0.4mlBET水1.0ml2.8ml2.8ml3.6ml3.2mlCSE混合5分钟E10E2E0.25E0.03CSE/E1002022-3-7Page 254、鲎试剂的准备 取TAL 1支，用砂轮在安瓿颈划痕，擦拭后从安瓿颈处折断（避免玻璃屑落入安瓿内）； 用刻度吸管或移液器准确吸取BET水1.25ml沿瓶壁加入安瓿内，轻轻摇匀，使内容物全部溶解（避免产生气泡）； 取反应试管11支，按2.0 EU/ml、0.25 EU/ml、0.03EU/ml各浓度平行3管，NC平行2管标记；2022-3-7Page

12、 265、软件系统的设置进入动态仪系统软件，根据试验要求，设置相关参数，如反应时间、预设透光度值等。填写相关的实验参数，使软件进入待采集状态2022-3-7Page 276、加样反应 先将复溶好的鲎试剂分装至各反应试管中，0.1ml/管； 分别将反应溶液加入各相应反应管中，一般按照从低浓度到高浓度的顺序加样，首先加阴性对照溶液； 加样完成后，将每支反应管内的混合液轻轻混匀后，插入动态仪中反应TAL2.0EU/ml0.1ml0.1ml0.1ml0.25EU/mlCSE0.1ml0.03EU/ml0.1mlNCBET水0.1ml0.1ml0.1ml加样顺序从低浓度到高浓度2022-3-7Page

13、28在动态仪中插入反应试管后，开始数据采集。 2022-3-7Page 297、结果判断药典要求 1、阴性对照的反应时间应大于标准曲线最低浓度的反应时间 2、标准曲线的相关系数|r|0.980厂家建议值 3、变异系数CV%10%关于相关系数当对一组数据作线性回归分析时，以相关系数r表示其标准曲线的线性状况，即该组数据的相关状况。当r值为正时，表示该组数据呈正相关关系；r值为负时，该组数据为负相关关系。当r值的绝对值|r|=1时，其标准曲线的线性最好。2022-3-7Page 30试验完成后进行数据分析2022-3-7Page 31试验完成后进行数据分析2022-3-7Page 32试验完成后进

14、行数据分析E0.3125E0.25E22022-3-7Page 333 ）干扰初筛试验目的及原理 只有在无干扰情况下，样品的内毒素检测结果才是有效的。 通过检测从供试品原液到其MVD或MVC之间的稀释液，计算内毒素回收率，判断供试品浓度对BET的干扰情况。2022-3-7Page 34试验步骤1、供试品限值的确定2、试剂的选择3、供试品最大有效稀释的计算4、反应溶液的制备5、加样及反应6、结果判断2022-3-7Page 35干扰初筛试验举例供试品限值 硫酸庆大霉素，100ml/瓶，5000U/ml； 药典要求，硫酸庆大霉素限值L=0.5EU/1000U2022-3-7Page 36试剂本试验

15、使用鲎试剂的检测范围为100.03EU/ml，选择标准曲线浓度为2、0.25、0.03EU/ml试剂名称试剂名称厂家厂家装量装量规格规格动态浊度法TAL安度斯1.25ml/支100.03EU/ml内毒素标准品（CSE）安度斯10ng/支10EU/ng（CoA）BET水（W）安度斯25ml/瓶内毒素0.003EU/ml2022-3-7Page 37最大有效稀释倍数的计算光度测定法中，供试品最大有效稀释倍数计算公式：MVD=cL/，其中为标准曲线最低点浓度本试验，MVD=5000U/ml x 0.5EU/1000U0.03EU/ml=80（倍）2022-3-7Page 38各反应溶液的制备溶液C的

16、制备E1000.4ml3.6ml WE100.8ml3.2ml WE20.4ml2.8ml WE0.25S原液0.4ml3.6ml WS101.4ml1.4ml WS201.4ml1.4ml WS401.4ml1.4ml WS80备用液0.4ml2.8ml WE0.03溶液A的制备E0.50.8ml2.4ml W备用液2022-3-7Page 39溶液B的制备E0.5S100.5ml0.5mlS20 E0.25E0.5S400.5ml0.5mlS80 E0.25E0.5S200.5ml0.5mlS40 E0.252022-3-7Page 40加样及反应取TAL两支，参照标准曲线可靠性试验中的方

17、法将其复溶；复溶鲎试剂后，运行软件，使其进入待采集状态；将两支复溶好的鲎试剂溶液合并在一起，轻轻混匀避免产生气泡；将鲎试剂液分装至20支反应试管中，0.1ml/管；将相应的溶液A、B、C、D加至反应管中，0.1mL/管，每浓度平行2管E0.03E0.25E2溶液C溶液DWS20S40S80S20E0. 25S40E0. 25S80E0. 25溶液A溶液A溶液A溶液B溶液B溶液B2022-3-7Page 41结果判断药典要求 1、阴性对照的反应时间（TD ）大于标准曲线最低浓度的反应时间（T） 2、标准曲线的相关系数|r|0.980 3、回收率R满足：50% R 200%厂家建议值 4、变异系数

18、CV%0.980TD（3600s）T20倍回收率40倍回收率80倍回收率试验有效试验有效有干扰有干扰无干扰2022-3-7Page 444）干扰试验根据干扰初筛试验结果，确定选择供试品的无干扰浓度选择3批供试品进行干扰验证试验溶液的制备方法与干扰初筛试验相同有干扰不理想无干扰2022-3-7Page 45溶液的制备A为稀释倍数不超过为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液的供试品溶液B为加入为加入 m内毒素且与内毒素且与A溶液有相同稀释倍数的供试品溶液溶液有相同稀释倍数的供试品溶液C为用于制备标准曲线的内毒素标准溶液为用于制备标准曲线的内毒素标准溶液D为阴性对照为阴性对照编号编号内毒素浓度内毒素浓度

19、配制内毒素的溶液配制内毒素的溶液平行管数平行管数A无供试品溶液不少于2个B标准曲线的中点（或附近点）的浓度（设为m）供试品溶液不少于2个C至少3个浓度（最低点设定为）检查用水每一浓度不少于2个D无检查用水不少于2个2022-3-7Page 46反应项目设置3批样品都在同一浓度做干扰验证试验每浓度平行2管溶液编号项 目平行管D阴性对照O OC内毒素标准(EU/mL)E0.031O OE0.25O OE2O OA1S80O OB1S80E0.25O OA2S80O OB2S80E0.25O OA3S80O OB3S80E0.25O O2022-3-7Page 47接受标准药典要求 1、阴性对照的反

20、应时间（TD ）大于标准曲线最低浓度的反应时间（T） 2、标准曲线的相关系数|r|0.980 3、各批样品的回收率R满足：50% R 200%厂家建议值 4、变异系数CV%10%2022-3-7Page 485）检查法（日常检查）根据干扰试验结果，选择无干扰的供试品浓度进行BET日常检查各反应溶液的制备及反应项目设置与干扰试验相同溶液编号项 目平行管D阴性对照O OC内毒素标准(EU/mL)E0.031O OE0.25O OE2O OAS80O OBS80E0.25O O2022-3-7Page 49结果判断药典要求 1、阴性对照的反应时间(TD)大于标准曲线最低浓度的反应时间(T) 2、标准

21、曲线的相关系数|r|0.980 3、各批样品的回收率R满足：50% R 200%厂家建议值 4、变异系数CV%10%若供试品溶液A所有平行管的内毒素浓度平均值乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，判供试品符合规定，否则判供试品不符合规定 无复测要求2022-3-7Page 504、终点比色法BET原理 当鲎试验的显色反应到达预设的反应终止时间（T0)时，反应混合液的吸光度值（OD）与内毒素浓度（C）成正比，利用标准内毒素建立OD-C的标准曲线，利用标准曲线定量测定供试品的内毒素含量。仪器 分光光度计 酶标仪 37恒温仪2022-3-7Page 51试验程序1. 试验准备：仪器及用具等2. 确定药品的细菌内毒素限值（L）3. 选择终点比色法试剂盒终点比色法鲎试剂显色基质（底物）工作标准内毒素（CSE） 4. 计算供试品的最大有效稀释（MVD）或最低有效浓度（MVC）5. 标准曲线的可靠性试验6. 干扰试验（验证）7. 检查法（日常检查）2022-3-7Page 52终点比色法日常检查举例试剂及