烟草培养方法以及转基因方法

1、烟草转基因预备工具：EP管灭菌 无菌水 Ms培育基 75%的酒精（蓝口小瓶） 升汞(要回收) 1ml枪 枪头 EP管架 计时器一、转基因(1) 无菌条件下，将烟草种子放入EP管中用无菌水冲洗2-3次；(2) 于75%的酒精中浸泡30-60sec；(3) 再用0.1%的升汞处理5min，最终用无菌水冲洗5次；(4) 播种于MS培育基上，培育在杭州师范高校生命与环境科学院植物学重点试验室组织培育室中，暗培育4天。25光照培育20-30天。 MS培育基 pH5.8 (5) 待烟草苗长至3-5cm时（20-30天），取顶芽放于MS+BA0.2 mg/L（壮芽，使其快速成长）培育基上，继代培育。(6)

2、继代培育14天后（有小叶片即可），取叶片，大小1cmX1cm，切去叶柄，叶片表面及叶边缘划伤，放入MS+ BA1.0mg/L pH6.0-6.5的预培育培育基上，正面朝下紧贴培育基放置，于黑暗条件下预培育2-3天。(7) 然后取出预培育的叶片或茎段，放入侵染液中进行侵染。侵染前一天晚上，摇菌农杆菌2瓶。将2ml离心管装满菌液，4000rpm离心5min，用悬菌液清洗两次。以1:10比例（10ml悬菌液放1管1.5ml菌体）放入悬菌液，加入As25mg/L（40ml中加40ulAs）不断摇摆侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液；(8) 将叶片

3、及茎段放回到预培育基上，28黑暗条件下共培育2-3天，至叶片切口四周有微菌斑形成；(9) 洗菌，取出共培育的烟草叶片及茎段，用添加500mg/LCef的无菌水冲洗5次，第一次放置于摇床摇30min，后面每次5min，以洗去外植体表面的农杆菌；(10) 取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培育基上，诱芽培育基为MS+ BA 1.0mg/L + Hyg25mg/L + Cef 500mg/L pH5.8； 过2周观看，假如发觉不长菌，则降低Cef浓度。假如长菌，则连续保持Cef浓度。(11) 每两周更换一次培育基，直至长出不定芽（一般状况为2周）。切下再生的小苗（1cm 左右），转入继代培育基MS+

4、 BA0.2-0.1mg/L+ Hyg25mg/L + Cef500mg/L pH5.8；(12) 至小苗长至2cm长时（有小芽即可），转接入生根培育基MS+ NAA0.2-0.1mg/L上，24 士1、12h 光照、1500lx 培育三周左右即可长出粗大根系。(13) 对生根的植株进行PCR初步检测，将结果呈阳性的植株经过炼苗后移到泥炭：蛭石=7:1的基质中，放入人工气候室进行培育，并对其生长状况进行观看、记录。农杆菌侵染液的制备(1) 取-80冰箱保存的含有表达载体的农杆菌，划平板培育，LB固体平板中加入50mg/L Kan和50mg/L Rif；(2) 挑取单菌斑到含50mg/L Kan

5、和50mg/L Rif的5mL LB液体培育基中，放入摇床中28、200rpm培育过夜（12h-16h）；(3) 保存菌种，750ul菌液加入灭过菌的甘油250ul，-80冰箱保存备用。(4) 摇菌，LB液体培育基10ml加Kan（所需浓度50mg/L）10ul、Rif（所需浓度50mg/L）10ul及菌液10ul，28、200rpm过夜培育（12h-16h）。(5) 当菌液浓度达到OD600=1.5左右时，取2mL菌液加入到离心管中，4000rpm离心5min；(6) 倒掉上清液，吸1mL新的MS液体培育基，重悬农杆菌，4000rpm离心5min。(7) 重复步骤（6）一次；(8) 用1mL

6、的MS液体培育基重悬菌后，再加入到40mL的MS的液体培育基中（含40ul 25mg/L的As），即为侵染液。放置2h以上，再侵染。200ml悬菌液 20x大量 10ml 200x有机 1ml 200x铁盐 1ml 200x微量 1ml 蔗糖5.6g二、烟草转化Hyg筛选压的确定由于所构建的载体具有潮霉素（Hygromycin,Hyg）抗性，所以转基因过程中需用Hyg进行抗性苗的筛选。以MS培育基为基础，添加不同Hyg浓度梯度进行试验，共设7个Hyg梯度：0 mg/L、5mg/L、10 mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L。取烟草叶片或茎段划伤口后分别接种到潮霉素的诱芽培