猪流感疫苗研究进展 (1).docx

1、猪流感疫苗研究进展陈永忠刘业兵二夏业才之(1.育海省西宁市畜牧兽医站，西宁810003；2.中国兽医药品监察所，北京100081)收稿日期12009-05-07文献标识码1A【文章编号|1002-1280(2009)060038-05中图分类号|S859.797摘要全面综述了国内外猪流感(SI)疫苗的研究现状。从激发体液免疫、细胞免疫、交叉保护以及避免母源抗体干扰和区分野毒感染等方面分别阐述了常规疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、病毒活载体疫苗的研究进展，以期找到最佳控制猪流感的疫苗及免疫方案，为进一步研究猪流感疫苗提供参考。关键词猪流感；病毒；疫苗ResearchProgressofS

2、wineInfluenzaVaccineCHENYong-zhong1,LIUYe-bing2,XIAYe-cai2(1.AnimalHusbandryandVeterinaryStationofXiningCityinQinghaiProvince,Xining810003;2.ChinaIrutUuieofVeterinaryDrugControltBeijing100081；China)Abstract:Thisarticlereviewedthecurrentresearchsituationofswineinfluenza(SI)vaccine.Itdetailedresearchd

3、evelopmentofswineinfluenzavaccinesinrespectofexcitationhumoralimmunity,cellimmunity,crossprotection,avoidingmaternalantibodyinterferenceanddifferentiatingfieldinfectionincludingconventionalvaccine,attenuatedvaccine,subunitvaccine,DNAvaccine,livevaccinebasedonvirusvector.Thisarticleprovidedreferences

4、fortheresearchofswineinfluenzavaccinesothathumancouldobtainthebestvaccineand作者简介：陈永忠(1970年-)，高级兽医师，大学本科，主要从事临床兽医方面的工作。E-mail：cyzl9700101vaccinationschemetocontrolswineinfluenza.Keywords：swineinfluenza；virus；vaccine猪流行性感冒(Swineinfluenza,SI),简称猪流感，是由猪流感病毒(Swineinfluenzavirus,SIV)引起的一种猪的急性、热性和高度接触性呼吸道传

5、染病。它不仅引起病猪高热、食欲减退、咳嗽、呼吸困难及出栏时间延迟等，而旦极易引起其他病毒和细菌的混合感染，使疫情变得更加严重。更重要的是，猪呼吸道上皮细胞表面同时存在人流感病毒受体SA2a22以及6Gal和禽流感病毒(AvianinHuen-zavirus,AlV)受体5入2022及36戒，这样猪既可感染人流感病毒，又可感染AIV,从而成为人和禽流感病毒重组的理想“混合器”。Ito等证实，AIV连续在猪体内传代，可产生人流感病毒样特性。因此,SI不仅给畜禽养殖造成了重大经济损失，而且对人类健康造成严重威胁,而有效的疫苗将会降低猪群中流感的发病率和猪作为人流感病毒储存库的可能性。近年来，猪流感疫

6、苗的研究已成为热点，并取得了很大的进展。本文就猪流感疫苗的进展作一综述,为进一步研究猪流感疫苗提供参考。1常规疫苗猪流感常规疫苗是灭活的全病毒疫苗,其形式多为常规油佐剂疫苗，灭活剂一般采用甲醛或BEIO猪流感疫苗中技术最成熟的主要是Hl亚型和H3亚型单价或双价猪流感全病毒灭活疫苗。灭活疫苗通过诱导机体产生抗血凝素(HA)、神经或酸恤(NA)等抗体，从而产生对感染的保护。对猪流感全病毒灭活疫苗免疫效果有重要影响的因素之一是疫苗毒株的选择，由于各地流行的SIV毒株在抗原性和遗传特性方而有所不同，所以疫苗株的选择一定要与当地流行毒株相匹配。例如，欧洲使用的疫苗大多含有较早分离NewJersey/76

7、(H1N1)株和PortChalmers/73(H3N2)株。美国目前使用的猪流感疫苗主要含有古典H1N1亚型SIV和三重排H3N2亚型SIV变异株，为了提高疫苗的针对性，美国一些猪场还特别使用本场分离株的“自家疫苗”。而我国研制的猪流感疫苗一般使用经过实验室培育的现地分离毒株。据报道，用H1N1和H3N2亚型的猪流感疫苗分别免疫4周龄和8周龄流感病毒血清阴性猪,2次免疫后3周，用H1N2亚型流感病毒气管内攻毒，中和试验表明免疫猪产生了针对H1N2的交叉反应抗体，并旦仅产生了温和的呼吸道症状，而对照猪产生了严重的呼吸道症状。Amy等使用灭活疫苗抵御异型病毒攻毒试验表明，当体内含有HlN2猪流感

8、病毒的猪，使用经典猪H1N1型流感病毒灭活疫苗免疫注射后，会使免疫保护失败，不同病毒不能够提供交又保护力，并H.会增加疾病的严重程度。Bikour等用H3N2SIV灭活疫苗加铝佐剂免疫小猪,2周后加强免疫1次。2次免疫后6d，用lOCIDH3N2SIV气管内攻毒，结果表明，试验疫苗诱导了高效价的针对H3N2SIV的血凝抑制(Hemagglutinationinhibition!)抗体,抑制了所有临床症状和病毒扩散，并减轻了肺的损伤。随着反向遗传技术的不断成熟,利用该技术在体外获得猪流感病毒人丁.标记疫苗株，进而研制出全病毒基因工程灭活疫苗的工作也已取得突破性进展，新疫苗不仅效价高，而且可以针对

9、流行毒株的变异情况及时调粮疫苗株的组成部分，节省了过去分离培育新毒株所消耗的大隋时间，具有良好的应用前景。Ruben等报道灭活疫苗能使发病率降低30%-70%,使死亡率降低60%87%。灭活疫苗对攻毒的保护情况与免疫后机体产生的抗体水平紧密相关，除了疫苗株外，其他一些因素，如抗原量、佐剂、免疫时猪的健康状况、适当的疫苗接种途径及适当的接种时机等均会影响疫苗的免疫效力。目前，灭活疫苗在欧美多个国家已实现商品化供应。例如，美国在1993年就已批准使用H1N1亚型单价猪流感疫苗,1998年又推出使用H3N2亚型单价疫苗和猪流感(H1N1+H3N2)双价灭活疫苗。国内的华南农业大学、中国农业科学院哈尔

10、滨兽医研究所等单位在猪流感油乳剂灭活疫苗研制方面做了大量工作，其研究结果表明，用国内分窗毒株培育后制备的H1亚型和H3亚型单价和双价猪流感油乳剂灭活疫苗经一次免疫后3周HI抗体效价即可达到1:160以上，免疫后4周HI抗体水平超过1：400,至免疫后12周HI抗体滴度仍可保持在1:100以上，超过1：80的有效抗体保护标准。如果进行二免，则HI抗体水平更高，免疫持续期可达到6个月以匕，能满足各种日龄猪只的防疫需要。对于H1亚型单价猪流感灭活苗的保护力，王文华的研究得到进一步证实,猪群抗H1亚型猪流感病毒HI抗体效价高于1:160时能完全抵御同亚型猪流感病毒攻击。多数免疫猪场将猪流感疫苗用于母猪

11、，尤其是产仔前。研究表明，母猪免疫接种对控制哺乳仔猪的流感发生非常重要，旦通常能在整个哺乳期提供保护。对于育肥猪通常很少实施免疫接种,但在易发生猪流感的老猪场，对猪群采取免疫接种措施是有益的。然而育肥猪的免疫接种可能很难与母猪的免疫接种结合起来，因为被动免疫时间的延K可能干扰仔猪的有效免疫接种。目前商品化的猪流感灭活疫苗对预防猪流感虽然发挥了重要作用，但是灭活疫苗的接种会对疫苗免疫猪与自然感染猪的鉴别诊断造成障碍,影响疫病的监测，并旦对异源和异型病毒不能提供有效保护，因此灭活疫苗很难有效控制抗原性多变的猪流感病毒在猪群中的感染与传播。另外，猪流感全病毒灭活疫苗还存在产生抗体较慢、诱导细胞免疫的

12、能力弱、应激反应强等不足。Heinen等比较了疫苗免疫猪和自然感染猪的免疫效果,发现疫苗免疫猪在攻毒后短期内排毒,而自然感染猪则得到完全保护，分析表明疫苗免疫猪产生了相同或更高的血清HI、病毒中和抗体及核蛋白(NP)特异的IgG抗体，但是鼻黏膜IgA滴度和淋巴细胞增殖反应较低，这可能解释了免疫后的亚保护状态。特别是疫苗生产毒株大多来自流行毒株，一旦疫苗制备过程发生病毒泄漏，容易造成环境污染，诱发新的疫情。为此，不断探索开发新型猪流感疫苗有着十分重要的意义。2减毒疫苗减毒疫苗一般是以生物学或其他方法降低或消除病原体的致病性，但保留了感染性和抗原性的一种活疫苗，因此能模拟动物白然感染状态来刺激免疫

13、应答,既可产生体液免疫，又可产生细胞免疫，为宿主提供长期的有效保护，但有毒力返祖和不同毒株间重组等风险。研究表明,SIV各亚型内的遗传和抗原异质性可能降低疫苗的效力"七为适应猪流感病毒抗原的多变性，需要开发能诱导不同亚型和毒株间交叉保护免疫的猪流感疫苗。感染H1N1亚型SIV的猪能部分抵抗H3N2SIV的攻击，攻毒后,发热和排毒比正常对照猪明显降低,病毒不能传播给同群非攻毒猪，并且未能检测到排毒。H1N1、H3N2和H1N2亚型HA基因是异源的，用H1N1或H3N2亚型疫苗鼻内接种，虽不能保护免疫猪不发病，但是免疫猪能对H1N2SIV攻毒表现出部分保护，与对照猪相比,鼻内排毒减少2d

14、,病毒复制明显减少，而且同时感染H1N1和H3N2的免疫猪对H1N2获得了完全保护，在肺和鼻分泌物中检测不到H1N2SIV,即使检测到，其含量也大大下降。然而，用商品化H1N1和H3N2双价灭活疫苗经肌肉接种，不能保护猪免受H1N2攻击'°）。这些结果说明活的SIV接种可提供不同费株间的交又保护。但是目谢还未能获得安全的SIV减毒疫苗株。Solorzano等"L通过分子生物学技术，获得了NS1基因部分缺失的H3N2SIV,实验表明，其毒力大大降低，有望作为猪流感减毒疫苗候选株。用NS1基因部分缺失的H3N2减毒疫苗免疫猪，然后用野生同型H3N2或异型H1NISIV进

15、行攻毒，可完全保护同型SIV攻击，虽不能阻止异型SIV对肺部造成的眼观病变，但是可显著降低肺部的显微病变和减少呼吸道病毒【。所有免疫猪血清中均产生了针对H3N2SIV的高水平HI抗体和ELISA抗体及黏膜IgA,而对NS1呈阴性反应。尽管异型免疫不能对感染提供完全保护，但对阻止猪群中流感病毒进一步扩散还是非常有效的。今后这类疫苗的发展方向是利用基因工程等手段研制出能够与野毒明显区别、不易返强、培养滴度高的人工标记弱毒株。但是目前还未能获得既安全又能满足临床应用要求的SIV减毒疫苗株。3亚单位疫苗亚单位疫苗是通过物理、化学方法或基因工程手段获取病原体主要免疫原蛋白而制成的一种疫苗，它可以有效避免

16、利用全病原体生产疫苗而导致的生物安全风险，并有利于提高疫苗中有效成分的浓度、纯度，以及开发多价、多联疫苗。而且因为只是病毒的特定蛋白在起作用，所以对于诊断、免疫剂量:等都可以达到人为控制的目的。灭活疫苗在预防猪流感时存在许多缺点,而研究发现亚单位疫苗可以在多方面起到补充作用。在常规疫苗中HA和NA同时存在于病毒粒子表面，抗原间存在竞争性抑制关系，HA对NA产生的T细胞和B细胞免疫有一定抑制作用,但是将HA和NA纯化后作为亚单位疫苗或作为常规疫苗的补充物可消除这种竞争关系。目前人用流感疫苗已经从第1代的全病毒灭活疫苗发展到第3代的全裂解病毒亚单位疫苗。新一代疫苗除去了病毒成分中与免疫功能关系不大

17、且对机体有应激作用的大分子蛋白及热源质，而将HA和NA浓缩,因此这种疫苗对机体的应激性小，接种后抗体上升快、维持时间长，具有很好的免疫效果，也具有更高的生物安全性。目前，在许多国家的人群中已开始全面使用第3代全裂解流感病毒亚单位疫苗。但这种亚单位疫苗的生产成本过于昂贵，短期内用于猪流感疫苗生产的可能性不大。对于猪流感亚单位疫苗,人们把更多希望放在构建基因工程疫苗方面:利用原核表达系统（大肠杆菌）或真核表达系统（酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等）在体外表达猪流感病毒流行毒株的HA基因和NA基因，然后收获、浓缩和纯化目的蛋白,再进一步制成疫苗。这种方法的优点是制备过程简弟、FI的蛋白含量大、主要成分

18、可以定量配置。但由于体外表达的蛋白难以维持或恢复天然蛋白的空间结构,蛋白纯化过程复杂、成本高，而且总体免疫效果尚不及传统的全病毒灭活疫苗，因此对这类疫苗的生产工艺还需进一步改进。4DNA疫苗目前研制的DNA疫苗在免疫途径、方法、程序等多方面还不成熟，免疫效果不稳定，离实际应用还有较大距离。商品化的猪流感疫苗通常是灭活的全病毒或亚单位疫苗，可以降低发病的严重程度和发病率，但不能对免疫猪提供完全保护。而DNA疫苗具有减毒疫苗的许多优点，且没有其毒力返祖和不同毒株间重组等风险，易于构建和制备，稳定性好，成本低廉,便于储存运输和注射，尤其是抗原被MHCI和MHCII类分子所递呈,能激发体液和细胞免疫反

19、应。Larsen等用表达HA的DNA疫苗免疫猪,初免后4周，再用灭活疫苗加强免疫1次，与单纯接种2次DNA疫苗相比,产生了更高水平的特异性抗体和更强的攻毒保护效果。根据SIV的HA、NA、NP和M（基质蛋白）等主要抗原表位基因构建的猪流感复合多表位DNA疫苗，在Helq细胞中表达的重组蛋白具有良好的抗原性"妇，可能是较理想的猪流感候选疫苗。最近,Tompkins等用表达A型流感病毒M2共同序列的DNA疫苗免疫小鼠,诱导出M2特异性抗体，并旦对致死性攻毒产生了保护。先用M2DNA疫苗初免，再用表达M2的重组腺病毒加强免疫，提高了与人流感病毒和禽流感病毒M2交叉反应的抗体，并且产生了T细

20、胞反应。实验结果表明，M2DNA疫苗初免并强化接种，能对致死性A型流感病毒（包括H5N1）攻击产生广谱保护作用。DNA疫苗能够同时诱导机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答,但由于DNA疫苗蛋白表达哒低，激发的免疫应答较弱，从而限制/它的应用,其中分子佐剂的应用是提高DNA疫苗免疫效果的重要举措。李国新等*证实，三拷贝分子佐剂C3d与分泌型HA融合后能够提高DNA疫苗诱导的抗体水平。5活载体疫苗活载体疫苗克服了灭活疫苗和亚单位疫苗的不足，同时具有弱毒疫苗的一切优点。母源抗体的存在对疫苗接种有负面影响,不仅延长了感染猪发热和临床症状，而且与无母源抗体的免疫猪相比，猪流感病毒对具有母源抗体的免疫猪诱导

21、的肺炎更加严重M,理想的疫苗还需要排除母源抗体的干扰，而活载体疫苗利用的是体内表达系统，所表达的蛋白更加真实，而旦因为病毒自身的复制能力，所以只需极少剂鼠的接种就可产生足够外源蛋白。重组活载体疫苗可同时启动体液免疫反应和细胞免疫反应，不会出现毒力返强，而且产生的保护性反应是针对载体病毒和外源蛋白来源病毒的，所以可达到一针防多病的目的。表达人流感病毒的H1N1、H3N2亚型HA的重组痘苗病毒能够诱导血凝素的产生，并刺激机体产生免疫反应。被用作载体的包括人腺病毒5型（humanadenovirus5,Had5）、猪腺病毒3型（porcineadenovirus3,PAV3）、猪伪狂犬病病毒（PRV

22、）、杆状病毒（Baculo-vinis）等。这类载体普遍具有容易插入外源基因且对外源基因的容钺大、自身相对稳定、基因组重排频率低、不与宿主基因发生整合等优点。表达SIVHA的重组伪狂犬病病毒（rPRV2HA）接种小鼠，在免疫后3周产生rSIVHI抗体，免疫后28d，用105TCID的异源SIV鼻内攻毒，从免疫鼠中未分离到攻毒株，仅在肺部观察到了轻微的病理损伤'脱。表明表达SIVHA的重组伪狂犬病病毒能保护小鼠免受SIV异源毒株的攻击,可以作为预防SIV和PRV的候选疫苗。Tang等"刃用含有H3N2SIVHA的重组腺病毒免疫小鼠，在免疫后2周产生了针对SIV的高水平HI抗体,

23、初免后3周再加强免疫，抗体水平大大提高。虽然是这些抗体不能中和异源病毒，但仍能保护免疫小鼠抗异源病毒的攻击。Wesley等对3周龄小猪分别免疫表达HA和表达HA与NP的重组腺病毒混合物，免疫猪群在4周内均产生了高水平的特异性HI抗体。免疫HA与NP重组病毒混合物的猪群获得了完全保护，攻毒后无鼻腔散毒和肺部损伤。因此猪群同时接种这两种复制缺陷型腺病毒疫苗对预防猪流感是有效的，与商品化疫苗相比的另一个优点是没有母源抗体干扰哺乳小猪的早期免疫），并旦这种复制缺陷型重组腺病毒不会传播给哨兵猪S）。目前华南农业大学开发的腺病毒载体猪流感已进入转基因安全评价阶段，应用前景戊好。由于母猪和小母猪缺少对人类腺

24、病毒5的质粒疫苗的免疫力，所以猪流感病毒的抗原可以使用这些疫苗（质粒）进行表达。Wesley等:的研究表明，用表达猪流感病毒血球漫集素和核蛋白的人腺病毒5重组病毒进行免疫后不存在母源抗体的干扰，7日龄的仔猪被H3N2感染的母猪哺乳，注射不能表达HA和NP的Ad-5质粒或者在初次免疫时使用具有目的基因片段复制缺陷的Ad-5病毒，该病毒原应表达SIVH3N2亚型血球凝集素和核蛋白。sham-注射组（对照）的HI检测的滴度显示持续性抗体水平下降，而在注射Ad-5SIV第二周后出现较强的免疫应答。在猪4周龄的时候,sham-注射组的HI滴度降到45,sham-注射组以及一半的Ad-5S1V免疫组猪体使

25、用商品化的SIV灭活疫苗进行二免。进行二免后,原来具有母源抗体干扰的猪体拥有较强的记忆应答，但是那些sham-注射的猪体不能够对商业化的疫苗产生免疫应答。由于母源抗体会干扰传统SIV疫苗的作用,这些重组Ad-5SIV疫苗对于免疫系统抵制母源抗体的作用是有效的。人们在不断开发新的活载体基因工程疫苗的同时，也在努力解决抗原浓缩、二次免疫受初次免疫抗体干扰、部分猪只对疫苗过敏等问题,希望不久的将来这类疫苗能够得到广泛的应用，可以作为传统全病毒灭活疫苗的补充。综上所述,猪流感常规灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗和活载体疫苗在生产和使用中各具优缺点。随着疫苗研究工作的不断深入，研制出安全、有效

26、的猪流感疫苗也只是时间问题，它必将为保障畜牧业健康发展、减少人类发生疫病的隐患做出应有的页献。参考文献：1GutierrezMartinCB,RodrigueDelgado0,AlvarezNislaal.SimultaneousSerdogicaEvidenceofActinobacilluspleuropneu-moniae.PRRS.Aujcszky*sDiseaseandInfluenzaVirusesinSpan,ishFini如ngpi快J.ResVetSci,2000,68(l)：9-13ItoT,CouceiroJN,Kdmal.MolecularBasisfortheGene

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