沙眼衣原体主要外膜蛋白亚单位疫苗的研究进展.docx

1、27DewsM.HovnayouniA,YuD,efaLAugmentationoftumorangiogenesisbyaMyc-activatedmicroRNAclusterJ.NatGenet,2006.38(9):10604065.：28ChenY,GorskiDH.RegulationofangiogenesisthroughamicruR-NA(miR-130a)thM!down-regulatesantiangiogenichomeoboxgegGAXandHOXA5fJ.Blood,2008.111(3)：1217-1226.29 FasanaroPD,Ale»&#

2、187;andraY,DistefanoV,elal.MicruRNA-210modulatesendothelialcellresponsetohypoxiaandinhibitsthereceptortyrosinekinaseligandEphrin-A3J.JBiolChemi,2008.283(23):15878-15883.30 LeeDY.DengZ,WangCH,elal.MicroRNA-378promotescellsurvival,tumorgrowthtandangiogenesisbytargetingSuFuandFus-lexpressionLJ.ProcNati

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8、P)的亚单位疫苗凭借其发展潜力，成为研究的热点。1CT亚单位疫苗简介亚单位疫苗是指用致病菌主要的保护性免疫原存在的组分(不含有核酸、能诱发机体产生抗体的某沙眼衣原体主要外膜蛋白亚单位疫苗的研究进展朱颍佳'(综述)，宁玉梅*(审校)(1.浙江中医药大学，杭州310053；2.浙江中防药大学附属第二阪院，杭卅310005中图分类号:R374.I文献标识码:A文章编号：1006-2084(2012)06-0804-04摘要：沙限衣原体主要外膜蛋白的亚单位疫苗成分无毒力，能诱导中和抗体和特异性细胞免疫反应产生，对机体起到预防和一定的特异性治疗作用，是有前途的新型疫苗之一。目瞥，疥究的直点集中于

9、主要分膜蛋白功能构象、府效T-B表位簿选及选择合适的费体佐剂增强免农原性，并探讨拾当的接种途径，诱导高效的抗体和绍胞免疫.同时加强诂膜防御。关*词：沙位衣原体；主要分胰蛋白；免疫化剂；接种ResearchProgressintheMajorOuterMembraneProtein-basedSubunitVaccineAgainstChlamydiaTrachomatisZHUYing-jia,N1NGYu-mei2.(1.ZhejiangTraditionalChineseMedicineUniversity.Hangzhou310053.China；2.theSecondAffiliate

10、dHospitalofZhejiangTradilionalChineseMedicineUniversity,Hangzhou3OOO5.China)Abstract:AChlamydiatrachomatismajoroutermembraneprotein-Uwed(MOMP)subunitvaccinecontainingnopathogeniccomponent.caninducebothlocalneutralizingantibodiesandcell-mediatedimmuneresponsetolimitinfection.Thisvaccineisonetrfthemos

11、tpromisingnewvaccines,playingrolesinpreventionandspecifictreatment.Al)oftheconformationofMOMPsubunittpredictionofeffectiveTandBcellepitopes,thedeliverysystemandadjuvant.aregreatlyrelatedtotheimmunogrnicityofvaccinetsoistheinoculation.ThroughtheresolvingofthesedifficultiesvtheeffectiveCt-MOMEsubunitv

12、accine.inducingyntcmicandmucosalonceitisinitialedvmaybedeveloped.Keywords:Chlamydiatrachomatis;Majoroutermembraneprotein；Immunologicadjuvants；Vaccination沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis,CT)是性传播疾病的重要病原体，还可引起眼部、呼吸道等全身多个系统症状。对抗生素耐药菌株的出现、再感染发病率增加和早期治疗的需要，表明建立一个有效的CT疫苗可能是控制人类衣原体感染最有效的措施。全菌疫苗可能由于某些免疫致病成分的存在,致使接

13、种者感染CT后较未接种者产生更为严重的基金项目：浙江牙自然基金(Y2I01423)种表面结构成分)制成的疫苗。它可以应用基因工程和免疫学技术，选择有抗原成分，剔除病理及感染性组分，在预防的同时也能起到一定的特异性治疗作用。预防CT感染疫苗的设计:应用一种亚单位作为疫苗，宜含有型特异性的保护性抗原，但与免疫病理性抗原不应有交叉反应；能覆盖多个主要致病血清型,特别是D-K型；在黏膜和全身诱导大量保护性抗体产生，并对入胞的衣原体启动有效的细胞免疫反应，主要是诱导干扰素7产生的Thl细胞免疫;增强免疫原性，对黏膜免疫系统的刺激须保持一定的持续时间。研究最多的是相对分子质量约为103.60X103和15

14、xIO,的衣原体外膜蛋白(oJiiermembraneproteins,OMPs)，分别为Omp-A、Omp-B和Omp-C基因所编码。其他一些具有较好免疫原性、可能更保守的抗原成分，也在研究中，且在动物模型中证明能发挥一定的保护作用.如多形态外膜蛋白、膜蛋白PorB家族、蛋白酶样活性因子等。其中，对CT-MOMP的研究相对较多。2CT-MOMP亚单位疫苗CT-MOMP蛋白占其外膜蛋白60%以上，由387397个氨基酸残基组成,0mpA基因编码，被认为是衣原体亚单位疫苗的靶抗原的优先选择。2.1CT-MOMP的结构、功能MOMP为一酸性的富含半胱氨酸的跨膜蛋白，天然构象是以&折叠结构为

15、主的三聚体，具有孔蛋白活性。三聚体的MOMP在温度437°C、pH5.0-8.0条件下，在十二烷基硫酸钠中稳定，并可抗胰蛋白酶消化。MOMP具有复杂的抗原决定簇，即抗原表位，如型特异性抗原决定簇、种特异性抗原决定簇和亚种特异性抗原决定簇等,可诱导机体产生特异性中和抗体及T细胞介导的免疫应答。对不同血清型的CT-MOMP蛋白氨基酸序列分析表明，各型CT-MOMP蛋白均有4个可变区(VD),分别镶嵌于5个高度保守的恒定区(CD)内。MOMP跨膜8次,N端和C端面向浆周间隙,4个VD环在表面，分别在氨基酸的64-83位(VDI).139-160位(VDII)、224237位(VDDI)和2

16、88-317位(VD1V),易与抗体接近，二硫键位于2个VD间的基底部6;而CD区为跨膜区，抗体难以接近。VD区序列的变异被认为是衣原体逃避免疫监视的机制。在MOMP的VD区中已发现了多个具有免疫原性的Th和CTL表位，在CD区也发现了一些T细胞表位。Thl细胞分泌的细胞因子可增强吞噬细胞介导的抗感染机制，特别是抗细胞内寄生菌的感染。Th2细胞分泌的细胞因子可增强B细胞介导的体液免疫应答。CTL通过释放穿孔素(perforin)来介导对靶细胞的杀伤，或通过T细胞表面的凋亡配体(FasL)与靶细胞表面的Fas结合，促使靶细胞发生凋亡。现已发现的B细胞表位均在可变区。B细胞在宿主抵抗原发和继发衣原

17、体感染中有重要作用，而且对于启动T细胞反应也是必需的。MOMP具有免疫保护性的表位主要位于可变区，不同型别的MOMP可变区氨基酸序列有一定的差异。这些研究对CT免疫学理解，致病机制阐明及亚单位疫苗的研究具有重要意义。2.2 MOMP保护性免疫原的选择2.2.1以整个MOMP作为疫苗的免疫原此种疫苗接种动物，可使之获得抗性而免受病原体的感染,并降低免疫病理反应发生的可能性。试验证明，从衣原体中提取的天然MOMP(nMOMP)免疫小鼠后对呼吸道和生殖道衣原体感染产生保护作用，对非人类的灵长类动物试验发现，可以对抗眼部感染刀。但应用nMOMP成本过高,所以作为替代，利用基因工程技术制备的重组MOMP

18、(rMOMP)在研究中广泛应用。原核表达系统是最早被采用，也是最成熟的。根据Gen-Bank中相应CT-MOMP基因序列设计引物，用高保真PCR方法从CT基因组DNA中扩增得到MOMP片段，克隆至载体，测序后行亚克隆，以重组质粒转化细菌，通过异丙基硫代半乳糖昔诱导表达并最终纯化获得所需的目的蛋白。许多实验显示,rMOMP所诱导的免疫反应不如nMOMP来得强大，这可能与它们空间结构和具体抗原组成不尽相同有关。单克隆抗体识别的构象表位，特别是三聚体的MOMP,在中和抗体衣原体感染方面，比识别线性抗原表位来得更有效，但rMOMP对机体的保护作用的研究价值是不容置疑的。2.2.2 以MOMP的肽段为免

19、疫原Welsh等报道，同一蛋白抗原中可能同时存在诱导正常抗感染免疫和病理性免疫应答的不同抗原表位。选取MOMP上免疫原性较强同时又具有较高安全性的表位作为免疫原，是比较理想的。携带有单个抗原表位的疫苗容易使变异病原体逃避机体正常免疫监视，如果这些免疫监视是建立在抗多个不连续抗原位点抗体上，那么逃逸现象就可能大大减少。一般说来，变异株的抗原位点全部发生变异的可能性较低，故现多选取多个或多种表位组合方式。MOMP多抗原(multipleantigenpeptide,MAP)疫苗是按照衣原体MOMP抗原基因中已知或预测的某几段抗原表位的氨基酸序列，用人工方法获得抗原肽，或使天然蛋白降解为小片段，利用

20、免疫学和基因工程技术筛选出具有免疫活性的片段或有中和特性的单克隆抗体识别相关抗原表位，对其进行优化,将同一病原体的不同细胞表位或者不同亚型病原体的细胞表位串联表达，然后配以适当载体与佐剂制成的新型疫苗。形式如串联抗原肽抗原，通过把相同或不同的肽段串联起来以增大抗原分子的相对分子质量；树状多抗原肽抗原以赖氨酸(Lys)为核心含有2n个抗原肽的抗原.等。但是也存在不足：遗传背景限制了抗原表位肽的表型，MAP疫苗仅代表了蛋白抗原的一部分;B细胞和T细胞抗原表位很难发挥协同作用;肽段是线性的，通常不具备抗原蛋白上抗原表位所具有的立体构象，免疫原性较蛋白弱。2.3增强MOMP亚单位疫苗免疫原性2.3.1

21、注重表位筛选及构象在MOMP疫苗研究中,需注意B细胞表位和T细胞表位的特点、T细胞应答的主要组织相容性复合体限制性及抗原呈递的特异性。表位筛选常用方法有:计算机软件预测法、化学或生物学方法（包括酶切割法和水解抗原-抗体复合物法）、肽探针扫描法、噬菌体表面展示技术、X线衍射法等。疫苗设计的抗原表位的组成和组合方式,影响对B细胞表位的特异性免疫应答，以及应答水平。T细胞表位是线形构象,B细胞表位是空间构象。B细胞经T细胞非依赖途径产生IgM为主的抗体，维持时间短，无免疫记忆；而经T细胞依赖途径能诱导IgG为主的长效、有记忆的抗体免疫。所以理想的免疫原要同时包含目的抗原B细胞表位和自身或外源T细胞表

22、位，可诱导出高度特异性的体液或细胞免疫反应。另外,通过设计隐藏于抗原分子内部的表位可增强抗原的免疫原性o蛋白质分子的化学结构决定其活性，影响活性的结构因素主要为氨基酸及其排序、末端基团，肽链和二硫键位置等,但蛋白质的空间结构即二维、三维结构也同样影响生物活性。单克隆抗体可识别MOMP上的线性和构象表位,构象表位识别引导的抗感染效力似乎更大。为了刺激有力的保护作用,rMOMP尽可能模仿nMOMP的结构是必需的，而多表位构建免疫原时，也需注意组合方式或骨架，以保持空间构象，更好识别。2.3.2载体和佐剂的应用一般来说单独使用MOMP或抗原决定簇的免疫原性较弱，所以通常要与载体耦联,或连接于骨架分子

23、以维持空间构象，或以融合的形式进行免疫，还可以与佐剂一起作用，以提高免疫原性，增进抗原与黏膜之间的传递以及免疫接触，优化免疫应答。有些载体同时具有佐剂活性。CT疫苗常用载体目前研究较多的载体是基因工程的方法构建的活重组细菌和病毒载体,其优点是能表达目的抗原，一个载体可以同时呈递多种抗原，无毒或少毒，但仍能增殖和入侵黏膜表面。一次免疫可在体内复制而引起长久的免疫应答,并有免疫调节功能。重组霍乱弧菌是一种有效的载体和CT蛋白克隆传递系统。重组霍乱弧菌-MOMP,通过肌注接种小鼠后，可诱导生殖道黏膜局部和系统性Thl免疫反应的增高。鼠伤寒沙门菌可以通过特殊的黏膜上皮M细胞进入机体，穿过

24、上皮屏障将抗原物质转运至细胞内，从而产生由上皮内或上皮下淋巴细胞介导的初级免疫应答;还可以被树突状细胞（dendriticcell,DC）直接摄取进入机体,获得高效激活T细胞的能力。减毒活病毒性载体是利用重组DNA技术将外源基因插入经过改造的病毒基因组内部，而后感染细胞，使外源基因维持一定时间的表达，以刺激机体产生特异性免疫应答。冷适应减毒活病毒疫苗被美国食品药品管理局批准用于人类。如以流感病毒为载体,传递目标抗原，刺激鼻黏膜相关淋巴组织，在黏膜和系统产生针对病原体的抗原特异性免疫反应已经成功。鼻黏膜相关淋巴组织不仅对鼻内摄入的抗原产生局部免疫，还能诱导远处的黏膜产生免疫反应。重组A型流感病毒

25、，作为CT免疫表位的载体，可有效诱导特异性TH1型免疫反应，抗生殖道衣原体感染。另外，非传染性重组减毒腺病毒载体、痘病毒等多种病毒载体在MOMP疫苗中的应用也在尝试中，但在筛选靶向性好、组织特异性强且可精确调控的病毒性载体方面还有大量工作要做。佐剂的应用佐剂是能够增强对疫苗组分抗原特异性免疫应答或改变免疫反应的。在CT疫苗研究中,使用较多的佐剂有:CT、大肠埃希菌不耐热肠毒素（LT）等，可提高特异性体液免疫和细胞免疫功能，增强黏膜免疫;CpG基序,激活抗原呈递细胞，优势诱导Thl型免疫应答;皂角昔类，如QS21,刺激白细胞介素2、干扰素yJgG产生,可诱导Thl、Th2和细胞毒性

26、T细胞的免疫应答;脂质体类，主要诱导B细胞为主的免疫应答，产生高水平IgG,也可促进淋巴细胞增殖。此外,还有免疫刺激复合物、生物降解微粒等。在CT-MOMP疫苗的研究中，佐剂CT和CpG应用相对较多。霍乱毒素可提高抗原呈递细胞呈递抗原的能力，是最强大的黏膜佐剂之一，由1个A亚基和5个B亚基组成,能诱导CD?Thl、Th2细胞免疫功能，并能够刺激黏膜分泌IgA抗体3】。霍乱毒素的肠毒性限制了其作为免疫佐剂的应用，而其无毒性但有免疫佐剂活性的受体结合亚单位研究较多。多项研究表明，通过滴鼻、阴道或经皮使用无毒的CTB亚单位疫苗，能诱导黏膜和系统的免疫。而CpG基序作为黏膜佐剂，可以直接激活抗原呈递细

27、胞,诱导其产生白细胞介素12、肿瘤坏死因子a等Thl型细胞因子，还可间接剌激自然杀伤细胞分泌干扰素”诱导Thl型免疫应答。CpG与Toll样受体9结合，与作为接头蛋白的髓分化因子88（MyD88）形成信号通路，使免疫反应偏向Thl型3】。有研究表明,CpG与霍乱毒素合用作为蛋白疫苗的佐剂具有协同作用,既能诱导强的黏膜抗体的产生又能诱导Thl类占优势的细胞免疫'。2.4接种疫苗途径疫苗的给药途径影响免疫反应的强度和性质。肌肉组织血流丰富及皮肤富含抗原呈递细胞，抗原呈递及传递能力可能剌激机体产生全身系统的免疫能力，两者为常用免疫接种方式。口服免疫刺激性最小，也在研究中被应用，但其免疫效果容

28、易受到肠上皮细胞膜、胃酸和各种消化酶的影响。衣原体感染涉及结膜、呼吸系统，胃肠道和泌尿生殖道等，因此在各种黏膜引起强烈的免疫反应至关重要。根据共同黏膜免疫系统的概念,某一部位摄入的疫苗能够诱导多个远处黏膜部位的免疫，且黏膜可以分泌IgA,有丰富的抗原呈递细胞以及调节型T细胞，故黏膜可以作为CT疫苗有效的免疫途径之一。目前对减毒和衣原体亚单位疫苗的研究已证明，滴鼻是提供呼吸系统和生殖器保护的最有效方法"8）。鼻部上皮细胞间隙较大并与毛细血管紧密相连，血管和淋巴管丰富，能直接进入全身血液循环，抗原不被暴露在低pH值和含有大量分泌的降解酶的环境下。但滴鼻有时也有不良反应产生，如面瘫等,可能

29、与其邻近中枢神经系统有关。舌下和直肠黏膜等途径也在被探讨，且能起到一定保护作用。而结肠给药相对经口途径，更能刺激阴道和结肠黏膜的IgA水平和血清IgG水平,可能是性传播疾病疫苗的适当免疫途径3迥。全身合并黏膜途径也许比任何单独的系统或黏膜免疫接种提供了更好地保护。3小结与展望CT-MOMP亚单位疫苗在CT的防治中显示出极大优势和潜力，成为研究的重点方向之一。在疫苗制备中需要考虑以下几个方面:疫苗需能覆盖多个主要致病血清型产生交叉反应。能在黏膜和全身诱导大髭保护性抗体产生，并对入胞的衣原体启动有效的细胞免疫反应cCT-MOMP尽管目前尚没有诱导病理性免疫反应的证据，但研制时仍需排除其诱导VED可

30、能。合理设计,减少逃逸现象，并使所选T、B表位能发挥协同作用。设计疫苗时应注意尽可能保持正确的空间构象。增强免疫原性，选择合适载体呈递抗原，或将多个表位连接于树状多臂骨架分子，免疫佐剂与抗原表位联合应用亦可增强免疫效应。不同的疫苗成分组合,其所诱发最大免疫效应的途径不同，要选择适当的疫苗入体方式等。尽管目前有许多关键因素还在探索，也存在着一些缺陷，相信随着基因工程和免疫技术的发展、抗原表位的进一步鉴定、空间构象的完善、主要组织相容性复合体限制作用的减弱,CT-MOMP亚单位疫苗必将在人类和动物CT的防治中发挥巨大作用。参考文献1BmnhamRC,Rey-LadinoJ.Immunologyof

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