Ghrelin和Obestatin对大鼠空间学习记忆能力影响

1、Ghrelin和Obestatin对大鼠空间学习记忆能力影响    【摘要】  目的 探讨Ghrelin和Obestatin对正常大鼠空间学习记忆能力的影响。方法 大鼠随机分为Ghrelin高剂量组、低剂量组和对照组1;Obestatin高剂量组、低剂量组和对照组2。Ghrelin各组双侧海马CA3区微量注射不同剂量Ghrelin和等量生理盐水;Obestatin各组侧脑室微量注射不同剂量的Obestatin和等量生理盐水。应用水迷宫方法检测大鼠的空间学习记忆能力。结果 水迷宫隐匿平台实验中Ghrelin高剂量组的潜伏期与对照组1相比明显缩短，

2、撤平台实验中Ghrelin高剂量组在原象限游泳的时间和总路程的百分比与对照组相比明显增加。Obestatin各组在隐匿平台和撤平台实验中的结果都没有统计学差异。结论 海马微量注射Ghrelin可明显提高大鼠的空间学习记忆能力，该作用可能与Ghrelin激活海马部位有关;侧脑室注射Obestatin, 在水迷宫实验中未能观察到大鼠空间学习记忆能力的提高。  【关键词】  Ghrelin;Obestatin;学习;记忆;海马;大鼠 ABSTRACT Objective To explore the effects of Ghrelin and Obestatin on the

3、ability of learning and memory in rats. Methods Rats were randomly divided into six groups as: highdose Ghrelin (HDG), lowdose Ghrelin (LDG) and control1; highdose Obestatin (HDO), lowdose Obestatin (LDO) and control2. Different doses of Ghrelin and same amount of normal saline were given by microin

4、jection into the hippocampus CA3 in Ghrelin group; Different doses of Obestatin and same amount of normal saline were given by lateral cerebroventricular injection (icv). The ability of learning and memory was tested by Morris water maze. Results The latency of swimming time and distance in the HDG

5、were decreased significantly compared with that in the control group. In the probe test, the rats in HDG stayed longer time and swimming distance in the origin quadrant were longer than that of the control group. The results showed no difference between Obestatin groups and control group in the hidi

6、ng platform test and probe test. Conclusion Microinjection of Ghrelin into the hippocampus has an effect of improving the ability of learning and memory in rats, whereas icv injection of Obestatin has no such effect. KEY WORDS Ghrelin; Obestatin; Learning; Memory; Hippocampus; Rats Ghrelin是1999年KOJI

7、MA等1发现的生长素促分泌素受体1a(GHSR1a)的内源性配体。大量实验表明，Ghrelin具有很强的刺激生长激素释放、促进摄食、减少脂肪分解等作用2。由于Ghrelin在机体饥饿状态下主要由胃黏膜泌酸腺A细胞分泌，因此大量实验集中于Ghrelin对摄食的启动作用和能量平衡的调节作用的研究。最近的研究结果表明，脑室和外周给予Ghrelin具有促进正常大鼠学习记忆的能力3,4。Obestatin与Ghrein是来源于同一个基因的肽类激素，对它的报道目前有许多争议。ZHANG等5指出，大鼠腹腔和脑室内注射Obestatin均可以抑制摄食。但是有研究表明，Ghrelin可借助特殊的转运系统通过血脑

8、脊液屏障，而Obestatin却不能通过该屏障，并且它在血液中很快地被降解6。HOLST等7甚至认为，Obestatin并非GPR39的配体。GOURCEROL等8报道，腹腔内注射Obestatin (30、100、300 mg/kg)并不影响累积摄食量。关于Obestatin对学习记忆能力的影响，VALERIA等9通过跳台实验和十字迷宫实验证实，Obestatin有增强记忆和促焦虑的作用。本实验采用双侧海马CA3区微量注射Ghrelin、侧脑室微量注射Obestatin，用水迷宫的方法观察其对大鼠空间学习记忆能力的影响。 1 材料与方法 1.1 动物及分组 选用健康成年雄性Wistar大鼠4

9、8只，体质量为250280 g，由青岛市药检所提供。置25 室温下，昼夜循环光照，自由饮水。大鼠随机分为6组：对照组1、Ghrelin低剂量组和高剂量组;对照组2、Obestatin 低剂量组和高剂量组，每组8只。 1.2 双侧海马侧脑室埋管术 术前动物禁食1520 h，采用80 g/L水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，肛温维持在(37±1)。用耳杠将大鼠头部固定在立体定位仪上，使前后囟位于同一水平。充分暴露颅骨，以牙科钻于颅骨表面双侧海马CA3区(前囟后3.0 mm，正中线旁2.8 mm，埋管深度3.2 mm)和侧脑室(前囟后1.0 mm，正中线旁1.4 mm，埋管深度2

10、.7 mm，参照PaxinosWatson图谱，1998)钻透颅骨，注意切勿损伤大脑皮质，清除硬脑膜后将长14 mm、内径相当于7号针头的不锈钢外套管置入双侧海马CA3区。以502胶和牙托粉固定外套管，外套管内置入内芯，防止堵塞。术后腹腔注射青霉素10万单位一次。分笼饲养5 d，自由饮食进水。 1.3 给药方法 手术后第6天开始注药，动物在无束缚状态下给药。注药管内径为0.2 mm，CA3区注药深度为3.3 mm，注药时间为2 min，然后停针2 min。侧脑室注药深度为3.8 mm，注药时间2 min，然后停针2 min。对照组1双侧海马微量注射无菌生理盐水各1 L; Ghrelin 低剂量

11、组大鼠双侧海马微量注射0.03 mmol/L的Ghrelin各1 L;Ghrelin高剂量组双侧海马微量注射0.3 mmol/L的Ghrelin各1 L。 Obestatin低剂量组侧脑室微量注射Obestatin为0.03 nmol(5 L);Obestatin高剂量组侧脑室微量注射Obestatin为0.3 nmol (5 L);对照组2侧脑室微量注射无菌生理盐水各5 L。每天注药一次，连续给药5 d。 1.4 Morris水迷宫实验 用于测量大鼠对水迷宫学习和记忆的能力。实验共历时5 d，测试前1 d让大鼠自由游泳2 min;第14天，每天上午10:0012:00进行训练，以避免日节律差

12、异。每天训练4次，每次训练90 s。训练时随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，观察并记录大鼠寻找并爬上平台的路程、所需时间(潜伏期)。4次训练大鼠分别从4个不同的入水点入水，如果大鼠在90 s内未找到平台，需将其引至平台，并使其在平台上停留30 s。这时潜伏期记为90 s，每次训练间隔30 s，统计4次的潜伏期的平均值。在第5天撤除水中平台，然后在原平台象限的对侧象限，将大鼠面向池壁放入水中，测其在90 s内在各象限的游泳时间、游泳距离及其占总时间、总距离的百分比。 1.5 统计学分析 应用SPSS 10.0及PPMS 1.510统计学软件进行处理，计量资料以均数±标准差表示

13、，组间比较采用方差分析。 2 结 果 2.1 Ghrelin的水迷宫实验 用药组与对照组大鼠每天双侧海马微量注射Ghrelin和生理盐水20 min后进行水迷宫隐匿平台训练，历时4 d。在训练过程中，大鼠寻找水中隐匿平台所需平均游泳时间和路程潜伏期见图1。从潜伏期变化可见，三组大鼠训练前2 d潜伏期迅速下降，从第3天开始趋于平稳，维持在一较平稳水平。前3 d三组之间时间和路程潜伏期比较，差异无统计学意义。第4天高剂量组的平均时间潜伏期为(9.12±0.93)s，明显低于对照组的(21.02±5.36)s(F=9.31,q=4.08，P<0.05)。高剂量组的游泳总距离

14、为(176.31±15.33)cm，也明显低于对照组的(416.84±105)cm (F=10.18，q=3.98,P<0.05)。第5天撤除水下平台，高剂量组大鼠原平台象限游泳时间占总时间的百分比为(42.65±4.50)%，明显高于对照组的(28.65±3.27)%(F=9.02，q=9.02,P<0.05)。高剂量组大鼠原平台象限游泳距离占总距离的百分比为(38.94±4.39)%，高于对照组的(26.68±2.45)%(F=12.22，q=8.04，P<0.05)。 2.2 Obestatin的水迷宫实验 用

15、药组与对照组大鼠均每天侧脑室微量注射Obestatin和生理盐水，20 min后进行水迷宫隐匿平台训练，历时4 d。在训练过程中，大鼠寻找水中隐匿平台所需平均游泳时间和路程潜伏期见图2。从潜伏期变化可见，三组大鼠训练前2 d潜伏期迅速下降，从第3天开始趋于平稳，维持在一较平稳水平。前4 d三组之间比较，差异无统计学意义。 第5天撤除水下平台，三组大鼠在各象限游泳时间及游泳距离占总时间、总距离的百分比各组之间也无统计学意义。 3 讨 论 海马是大脑内侧颞叶的主要结构，与人陈述性记忆的形成关系密切。啮齿类动物的海马是空间学习的必需结构，Morris水迷宫任务与空间学习直接相关; 海马在接受高频传入

16、冲动时突触效能发生改变，如长时程增强(LTP);当动物处于新的环境中时，海马个别的锥体细胞因位置改变而特异性放电。CARLINI等3研究显示，侧脑室注射Ghrelin引起焦虑并促进记忆。我们推测Ghrelin很可能通过海马部位起作用，所以选择把Ghrelin注射到海马。实验中双侧海马微量注射Ghrelin对正常成年大鼠的空间学习和记忆有改善作用，表现在隐匿平台实验中，高剂量组的游泳时间和路程都明显低于对照组。空间搜索实验中,高剂量组在原平台象限的游泳时间、距离占总时间、总距离的百分比都明显高于对照组。这与CARLINI等脑室注射Ghrelin通过跳台实验所得的结论一致，而且本实验是将Ghrel

17、in直接注射到海马部位，说明Ghrelin可以通过海马的神经环路发挥作用。 Ghrelin影响记忆的确切机制并不完全清楚。原位杂交技术表明除了下丘脑外，海马CA1区、CA3区和齿状回中均存在GHSR mRNA11;外周注射131I标记的Ghrelin表明，除下丘脑、皮质外，海马CA1、CA3区及齿状回均有Ghrelin的结合位点。所以，Ghrelin很可能与海马区的GHSR结合提高大鼠的学习记忆能力。DIANO4通过形态学和电生理等技术证实，外周的Ghrelin可明显提高海马CA1区树棘突密度，增强LTP效应，所以Ghrelin很可能是通过提高树棘突密度和增强LTP效应来影响学习记忆的。 本文

18、Obestatin的水迷宫实验结果并没有显示出它可以提高大鼠的学习记忆能力。这与CARLINI等的报道不相符合。可能的原因是CARLINI采用的是跳台实验，它是揭示动物记住某一行为的不良后果，在下次行动时有所犹豫，这主要反映了动物的非陈述性记忆。而我们的水迷宫实验主要反映动物的空间学习记忆能力，可能因为实验方法的不同而产生了不同的结果。另外，从Obestatin的生物学活性和受体方面考虑，它不能通过血脑脊液屏障，并且它在血液中很快被降解, 受体也不能确定是GPR39, 所以Obestatin是否可以增强学习记忆能力有待进一步讨论。 综上所述，双侧海马微量注射Ghrelin可以提高大鼠的空间学习

19、和记忆能力，Ghrelin的这种作用与激活海马部位有关;但是侧脑室注射Obestain并不能通过水迷宫实验观察到大鼠的学习记忆能力的提高。 【参考文献】   1KOJIMA M, HOSODA H, DATE Y. Ghrelin is a growth hormone releasing acylated peptide from stomachJ. Nature, 1999,229：291. 2董静,唐明. 神经肽ghrelin及其生物学特性J. 青岛大学医学院学报, 2005,41(4)：366368. 3VALERIA P, CAELINI. Ghrelin increase

20、s anxietylike behavior and memory retention in ratsJ. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2002,299:739743. 4DIANO S. Ghrelin controls hippocampal spine synapse density and memory performanceJ. Nature Meuroscience, 2006,9(3):381388. 5ZHANG J V, REN P G, AVSIANKRETCHMER O, et al. Obestatin, a peptide encoded by the ghrelin gene, opposes ghrelins effects on food intakeJ. Science, 2005,310:996999. 6PAN W, TU H, KASTIND A J. Ifferential BBB interactions of three ingestive peptides: obestatin, ghrelin, and adiponectinJ. Peptides, 2006,27(4):911916. 7HOLST B, EGEROD K