分子生物学写出一个研究功能基因组的思路刚

1、写出一个研究功能基因组的思路研究功能基因组的思路分为三个重要阶段,第一个阶段是目的基因的精细定位,第二个阶段是目标候选基因的功能验证，第三个阶段是基因的功能与基因进化研究。由于基因在基因组中有相对稳定的基因座位，在不清楚基因序列与所编码的蛋白序列信息的情况下，先利用分子标记技术（如Indel、SSR、SNP）对目的基因做精细定位。在获得定位结果之后，对目标区域的基因组序列进行测序分析和序列比对、生物信息学分析、cDNA测序和序列比对、以及基因表达模式分析等，确定目标候选基因。再用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选基因组文库（如YAC、BAC、TAC、PAC），构建目的基因区域的物理图谱，再通过染

2、色体步移（walking）逐步逼近目的基因或通过染色体登陆（landing）的方法找到包含该目的基因的克隆。再进行利用PCR技术获得全长目标基因片段，组装载体、遗传转化和功能互补实验等工作，最终克隆到目的基因。最重要的实验是功能互补实验，我目前所了解的情况如下。我研究的内容是水稻的某个雄性不育基因。在定位到该基因后，分两步。首先要构建干涉载体，利用农杆菌介导转化野生型的植株，如果野生型转化后表现为不育，则说明结果是阳性。然后要构建诱导载体，利用农杆菌转化不育株，如果不育株转化后表现为可育，则说明结果是阳性。克隆到该基因之后再进行基因功能与基因进化的研究。以下列出几种常用的研究功能基因组的方法。

3、1 RT-PCR & qRT-PCR RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。 real time PCR 的定量使用荧

4、光色素，目前有二种方法。一种是在ds DNA中插入特异的荧光色素，例如SYBR Green荧光染料；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种荧光探针（probe），如Taqman探针。两种方法原理不同。SYBR Green荧光染料游离时不发光，当反应体系中存在双链DNA时，SYBR Green与双链DNA结合，此时才发光。Taqman探针带有一个荧光基团和一个淬灭基团，荧光基团连接在探针的5末端，而淬灭基团则在3末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'3'外

5、切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，此时荧光基团发出的荧光信号可以被检测到。 real time PCR 与 reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”2原位杂交技术（in situ hybridization）的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待

6、测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物(曾呈奎等2000)。 RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交)，所形成的杂交体 (Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、

7、rRNA和tRNA分子。RNA原位杂交技术 经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已 成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。3 DNA microarray DNA微阵列技术是产生于90年代的一种分子生物学技术，也称为芯片技术，其原理是：在一块带有DNA微阵列涂层的玻璃片上，利用光导化学合成、照相平板印刷、固相表面化学合成等技术合成数百万个DNA探针，然后与用荧光或放射性同位素标记的DNA杂交，继而通过荧光强度或者同位素放射强度检测技术检测杂交信号强弱，从而确定细胞中特

8、定分子的相对表达水平。4染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）也称结合位点分析法，是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。ChIP-Seq的原理是：首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因

9、组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。5酵母单杂交系统（Yeast one-hybrid system）是上世纪90年代中发展起来的研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术。它的基本原理是将已知顺式作用元件构建到最基本启动子 （minimal promoter，Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin下游。将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域 （transcription-activating domain, AD） 融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活 Pmin启动子，使报告基因得到表达。利用酵母单杂技术，可识别结合DNA的蛋白

10、质；也可在酵母细胞内研究真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作用；同时也能通过筛选DNA文库直接获得与靶序列相互作用蛋白的编码基因。6酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system)的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子 GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中含有DNA结合功能域(DNA binding domain, DNA-BD)和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。

11、这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。 双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。 细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。 80年代的工作表明， 转录激活因子在结构上是组件式的(modular)， 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。 单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。 而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。 如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大