小分子发酵抗菌肽对禽用灭活疫苗抗体水平影响.docx

1、小分子发酵抗菌肽对禽用灭活疫苗抗体水平影响袁野"，李浩鹏2,邢小勇'胡永浩”(l.tf肃农业大学动物医学院，甘箫兰州730070：2.中牧股份(乾元浩生物股份仃限公司)，河南郑州450000)摘要：本试脸旨在研完小分子发酵抗菌肽对禽用灭活疫苗抗体水平的影响，采用将免疫增强剂小分子发碑抗菌肽分别添加于正常抗原含量及戒量抗原含量的新城疫ND-禽流感(H9F株)二联灭活苗，禽流感(H5N1亚型Re-6株.Re-7株)二价灭活苗中，分别免疫SPF鸡。同时用不加免疫增强剂的新城疫-禽流感二联灭活疫苗和禽流感二价灭活疫苗免疫SPF鸡作为对照组。结果表明，通过监测鸡免疫后不同天数的血清抗体

2、水平，发现抗原用量不变的情况下，试验组比对照组抗体效价均有提高；在抗原用量减少50%的卅况下试验组比对照组抗体效价也均有一定的提高。结果提示，小分子发酵抗菌肽对禽用灭活疫苗能起到一定的抗体增强的效果。关键词：免疫增强剂；小分子发酵抗菌肽;新城疫；禽流感；抗体滴度中图分类号：S859.797文献标识码：B文章编号：1672-9692(2016)01-00()8-07EffectofvaccineantibodylevelsbasedonFermentationantimicrobialpeptideofsmallmoleculeoninactivatedvaccineagainstavianYu

3、anYe1,2,LiHaopeng2,XingXiaoyong1,HuYonghao1*(1.CollegeofVeterinaryMedicineofGansuAgriculturalUniversity,GansuLanzhou730070；2.ChinaAnimalHusbandryIndustryCO.,LTD.ZhengzhoubiologicalpharmaceuticalfactoryofQYHBiotechCompanyLimited),HenanZhenzhou450000)Abstract:Theexperimentwasconductedtostudytheimpacto

4、fantibodylevelsonantimicrobialpeptideofsmallmoleculefermentationoninactivatedvaccineaboutavian.Wehadusedthesmal1moleculeimmuneenhancerwereaddedtothenormalfermentationantibacterialpeptideantigencontentandthereductionoftheantigencontentofNewcastlediseaseNDandavianInfluenza(H9Fstrain)duplexinactivatedv

5、accineandavianinfluenzaH5N1Re-6strainandRe-7strainbivalentinactivatedvaccineinSPFchickenswereimmunized.AdditionNewcastlediseaseandavianinfluenzaduplexinactivatedvaccineandavianinfluenzaH5N1Re-6strainandRe-7strainbivalentinactivatedvaccinewithoutimmuneenhancerimmunizedSPFchickensasacontrolgroup.There

6、sultsshowedthatmonitoringtheserumantibodylevelsofchickenbydifferentdaysafterimmunization,theamountofantigenwasfoundunderthesamecircumstances,theexperimentalgroupwereincreasedthanthecontrolgroupinantibodytiters,andreducingtheamountofantigeninhalfofcasesintheexperimentalgroupwereincreasedthanthecontro

7、lgroupinantibodytiters.Thestudysuggestthatantimicrobialpeptideofsmal1moleculefermentationinactivatedvaccineagainstavianantibodieswouldimprovethespecificenhancedeffect.Keywords:Immunostimulants;Antimicrobialpeptideofsmallmoleculefermentation;Newcastle：Avianinfluenza;Titerofantibody收稿日期：2015-11-02作者简介

8、:袁野(1983-),男，河南郑州人，博L研究生，主要从事生物制品、药品的研发与生产.通讯作者：胡永浩(1962-),男，甘肃古浪人，教授，硕士生导师.研究方向为动物传染病学。基金项目：国家高新技术研究发展计划(863计划)生物西药新产品研究和创制(2011AA10A214).新城疫(Newcastledisease,ND)和禽流感(avianinfluenza)是危霄禽类的重大疾病，其病原分别是新城疫病毒和禽流感病毒，都属于高度接触性传染病，对世界养禽业危害7。目前，新城疫和禽流感的预防主要是接种疫苗"，鸡新城疫疫苗主要有弱毒疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、基因工程苗而弱毒疫苗为目前市

9、场上最常见的疫苗。禽流感现阶段常见的疫苗为全病毒灭活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗、重组活载体疫苗心|。虽然使用常规疫苗免疫接种可以防治新城疫、禽流感，但在实际情况下常规单苗存在免疫繁琐，免疫效果不尽理想，成本高等缺点，针对市场的需求，进而研制出既节约成本乂增强免疫效果的免疫增强剂。小分子发酵抗菌肽属于有机肽类，具有广谱抗菌抗病毒活性网，无残留，无副作用，无酎药性，热稳定好，耐热100C,10min,使用方便，分子质量小，水溶性好，强碱性，还具有抗原虫杀痛作用仆。使用过小分子发酵抗菌肽的商盒(如禽饲喂适破)抗病能力增强，生产性能优良，经济效益度好。禽用疫苗的生产成本逐年增高，疫苗客尸群对疫苗免疫效

10、果的要求愈高，为能降低灭活苗成本，同时又能增强抗体的实用效果。本研究在正常抗原含量及减量抗原含量下，通过不添加免疫增强剂作为对照组，探讨小分子发酵抗菌肽对鸡体感染新城疫，禽流感的免疫调节作用，为应对新城疫，禽流感能够达到更加理想的免疫预防效果奠定了理论依据"叫1材料与方法1.1试验动物28日龄SPF鸡125只均购自乾元浩生物股份有限公司。1.2主要试剂小分子发酵抗菌肽：购自中农颖泰生物股份有限公司99%(纯品)°二硬脂酸铝：购自温州(20140102)o司本-80：购白广东省肇庆市超能实业有限公司(20131208)。吐温-80：购自广东省肇庆市超能实业有限公司(20130

11、419)1.3主要仪器M52：购自法国(VG5111304P)。T-18型台式微型剪切机购自德国IKA公司。LS900激光颗粒粒度分析仪购自青岛欧美克公司。八道移液器：购自德国艾本德公司。IKAT10微量乳化机、离心机：购自德国IKA公司。1.4疫苗疫苗由乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂提供。1.5小分子发酵抗菌肽的制备1.5.1小分子发酵抗菌肽水相的制备将5mg小分子发醵溶于5mL生理盐水(0.85%)中，使其浓度为1mg/mL(1yg/uL)：取含灭活抗原的水相2mL,加入上述小分子发酵溶液80UL,混匀待用，即为小分子发酵免疫增强剂疫苗的水相，最终疫苗中小分子发酵浓度达到10Pg/mL

12、o水相最终pH应为6.07.0o1.5.2小分子发酵抗菌肽油相的制备由中国牧工商集团总公司(乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂)提供疫苗油相，小分子发酵免疫增强剂疫苗需要6mL油相。1.5.3小分子发酵抗茵肽的乳化按中国牧工商集团总公司(乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂)8mL体积灭活疫苗配方，进行乳化配苗：将配制好的油相先与小分子发酵抗菌肽的水相用德国IKAT18型高速剪切机先进行预乳化，待将水相加入完全后，按一定转速、时间乳化结束，分装以备用于动物试验。1.6疫苗物理性状的检测取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，应呈油滴状不扩散为宜。取10mL疫苗于离心管中，经3500r/min离心1

13、5min,应不出现分层现象；疫苗在37C左右条件，放置21d不应有破乳现象为佳。用下口内径为1.2mm,上口内径为2.7mm的1mL移液吸管在25C左右的条件下吸取疫苗1mL,令其垂直流出，记录流出0.4mL所需的时间。取5PL疫苗混匀于10mL白油中，置于LS900激光粒度分析仪中检测。1.7疫苗无菌检测疫苗抽样，分别取硫乙醇酸盐培养基2支，琼脂培养基2支，葡萄糖培养基1支，每支接种疫苗0.2mL分别放置于37C,25C培养箱中做无菌检验。1.8免疫接种试验取3周龄的SPF鸡125只，分13组：第12组每组禽流感(Re-6+Re-7)免疫剂量0.3mL/羽，第1组添加小分子发酵抗菌肽：第34

14、组每组禽流感H9F株免疫剂量0.2mL/羽，第3组添加小分子发酵抗萌肽：第56组每组新城疫ND免疫剂量20UL/羽；第5组添加小分子发酵抗菌肽；第712各组每羽份在原有抗原含量基础上抗原含量全部减半：第78组每组禽流感(Re-6+Re-7)免疫剂量0.3mL/羽，第7组添加小分子发酵抗菌肽；第910组每组禽流感H9F株免疫剂量0.2mL/羽，第9组添加小分子发酵抗菌肽；第1112组每组新城疫ND免疫剂量20uL/羽；第11组添加小分子发酵抗菌肽:第13组取5只作为空白对照，不进行免疫接种。1.9HI抗体检测SPF鸡分别在免疫后21、28、35d采血、测抗体。2结果与分析2.1疫苗物理性状的检测

15、添加小分子发酵抗菌的疫苗颜色无变化，呈乳白色，无破乳现象，且无分层现象，粘度、颗粒度也和普通疫苗无明显差异。2.2疫苗的无菌检测添加小分子发酵抗菌的各组疫苗均呈无蔺状态。2.3疫苗的免疫试验2.3.1抗原含量正常时禽流感(Re-6株、Re-7株)疫苗的免疫增强试验结果一对照组-实臆组58587Apoq=ue王W较毋蛤一H71121d28d35dSPF鸡日龄/dTime图1Re-6株试验结果Fig,1ExperimentalresultsofRe-6diseasedplant21d28d35dsa-s>>poq=UEihW聚型垢XSPF鸡日龄/dTime图2Rg-7株试验结果Fig.

16、2ExperimentalresultsofRe-7diseasedplant免疫后结果显示，抗原含量正常时，由图1和图2可以看出，禽流感H5N1Re-6株和Re-7株，试验组比对照组均有增强效果。并且，从28d到35d,试验组、对照组抗体效价均呈上升趋势：由图1诃以看出，Re-6株试验组比对照组抗体效价提高明显，21d时，提高0.4个滴度，28d时提高1.0个滴度，35d时提高1.1个滴度；由图2可以看出，Re-7株试验组比对照组抗体效价均有提高，在21d时,提高0.7个滴度，28d时提高0.2个滴度，35d时提高0.2个滴度。2.3.2抗原含量正常时新城疫ND、禽流感H9F株疫苗的免疫增强

17、试验结果6对照蛆Y-实教蛆5.5*.21d28dSPF鸡日龄/dTime图3ND试验结果Fig.3ExperimentalresultsofND图4H9F株试映结果Fig.4ExperimentalresultsofH9Fdiseasedplant理Apoq-iDX由图3可以看出，ND试验组比对照组抗体效价略有提高，28d时提高0.2个滴度，35d时提高0.4个滴度：由图4可以看出，F株试验组比对照组抗体效价提高明显，其中，21d时，比对照组提高0.8个滴度，28d时，比对照组提高0.7个滴度，35d时，比对照组提高0.3个滴度。2.3.3抗原含量减半时念流感（Re-6株、Re-7株）疫苗的免

18、疫增强试验结果29864289.&&&&ApoqleX金摄毋信X一一对照组-实验组SPF鸡日龄/dTime图5Re-6株试验结果Fig.5ExperimentalresultsofRe-6diseasedplant6.5-、61'21d28d35dSPF鸡日龄/dTime图6Re-7株试验结果Fig.6ExperimentalresultsofRe-7diseasedplant9585787se-sApoq=u任h蠢蓄H-对照组实驶组由图5和图6可以看出，Re-6株和Re-7株，试验组比对照组都有一定增强效果；由图5可以看，Re-6株试验组比对照组抗体效

19、价均有提高，21d时提高0.6个滴度，28d时提高0.3个滴度，35d时提高0.1个滴度；由图6可以看出，Re-7株试验组比对照组抗体效价均有提高，21d时提高0.5个滴度，28d时提高0.2个滴度，35d时提高0.6个滴度。2.3.4抗原含量减半时新城疫ND、禽流感H9F株疫苗的免疫增强试验结果由图7和图8可以看出，ND、F株试验组比对照组均有提高；由图7可以看出，ND试验组比对照组均有提高，21d时，提高0.5个滴度，28d时，提高0.5个滴度，35d时，提高0.4个滴度；由图8可以看出，F株试验组比对照组略有提高，28d时,提高0.2个滴度，35d时，提高0.4个滴度。3讨论抗菌肽是一类

20、由原核动物与真核动物体内均能合成的多肽，具有小分子、强阳离子性、热稳定性好、无药物屏蔽且不影响真核细胞等特点。抗萌肽通常作用于细菌，在真核生物的天然免疫方面发挥着重要作用，被认为是古代进化中哺乳动物体内有效保留的免疫分子"。刘莉如等由通过饲粮添加天蚕素抗菌肽可不同程度提高蛋用仔公鸡生长性图7ND试验结果Fig.7ExperimentalresultsofNDSJO-SApoqnuwI卒与姓垢XSPF鸡日龄/dTime图8H9F株试验结果Fig.8ExperimentalresultsofH9Fdiseasedplant能、免疫器官指数，并能有效降低前炎性细胞因子基因的mRNA相对表达

21、水平。抗菌肽一般通过饲料添加的方式以提高动物机体的免疫水平，但作为疫苗免疫增强剂研究不多见。本试验通过在抗原量相同的情况下，随着动物免疫天数的逐步增加，对于同种抗原而言，小分子发酵抗菌肽的添加组比同抗原不添加组抗体效价均有所提高，禽流感试验组比对照组抗体效价均有提高，新城疫ND试验组比对照组抗体效价略有提高，禽流感F株试验组比对照组抗体效价提高明显。试验结果表明，在兽医免疫中，小分子发酵抗菌肽可以作为疫苗添加剂以增强免疫效果。本试验还通过在抗原用量减少50%的情况下，小分子发酵抗茜肽的添加，使得禽流感试验组比对照组抗体效价有所提高，而新城疫ND试验组比对照组均有提高，禽流感F株试验组比对照组略

22、有提高;在抗原用量减少50%时，试验期望达到正常抗原含量试验中的抗体效价水平，而从不同抗原含量的试验结果看，在抗原用量减少50%情况下，禽流感(Re-6+Re-7)、新城疫ND和禽流感F株抗体效价均比对照组高。本试验对小分子发酵抗菌肽作为禽用疫苗免疫增强剂进行初步研究，试验结果表明，小分子发酵抗菌肽对禽用灭活疫苗能起到抗体增强的效果。小分子发酵抗菌肽作为疫苗增强剂应用前景广泛，但作为疫苗增强剂的最佳添加剂量、添加时间以及免疫增强机制都有待进一步研究。参考文献ALEXANDERDJ,ALDOUSEW,FULLERCM.Thelongview:aselectivereviewof40yearsof

23、NewcastlediseaseresearchJ.AvianPathol,2012,41(4):329-335.1 ALEXANDERDJ.NewcastlediseaseintheEuropeanUnion2000to2009J.AvianPathol,2011,40(6):547-558.2 王志全，丁嗣，梁媛媛.新城疫研究进展及综合防治J.中国畜禽种业,2014年第102卷第2期：136-137.3 王贺民，秦素琴，魏涛，等.鸡新城疫疫苗研究进展J.中国家禽,2006,28(18)：48-51.4 雷彩霞，夏业才，李俊平.中国禽流感诊断技术和疫苗的研究进展J.中国兽药杂志,2006(1

24、):32-39.5 武发菊，刘学荣，尚勇良，等.新城疫疫苗的研究进展J.中国畜牧兽医,2011,38(10)：145-148.6 SpradbrowPB.Newcastlediseaseinvillagechickenscontrolwiththermostableoralvac-cineJ.VirusRes,1994(32):373-379.7 HaroIdoToro,De-chuC,Tang,etal.Protectiveavianinfluenceinovovaccinationwithnon-replieatinghumanadenovirusvectorJ.Vaccine,2007,25:2886-2891.8 NeumannG,KawaokaY.ReversegeneticsofinfluenzavirusJ.Virology,2001,25:243-250.9 杜淑环，刘秀明，万秋，等.天蚕素抗菌肽的研究进展J.动物营养学报,2012,24(1):41-47.10 陈琛，吴三桥，李新生，等.抗菌肽SMAP-29结构功能及分子设计策略J.生物工程学报，2011,27(6)：846-8