异丙酚对体外循环患者核因子κB活性及整合素CD11b表达的影响

1、异丙酚对体外循环患者核因子B活性及整合素CD11b表达的影响 作者：蔡伟华， 曹殿青， 张晓春【摘要】 目的：观察异丙酚对体外循环（CPB）患者中性粒细胞（PMN）核因子B（NF-B）活性及整合素CD11b表达的影响。 方法：将30例行CPB心瓣膜置换术病例随机分成观察组（异丙酚麻醉维持组）和对照组（咪唑安定麻醉维持组），每组30例。分别于麻醉前、CPB开始后30min、CPB停止后30min、4h、24h抽取挠动脉血3ml，运用电泳迁移率实验检测NF-B活性，流式细胞仪检测CD11b表达水平。采用X2检验和t检验进行组间差异的统计学分析，比较两组间PMN NF-B活性和CD11b的表达。结果

2、：两组患者PMN NF-B活性在CPB停止后30min达到峰值，观察组在CPB开始后30min、CPB停止后30min、4h、24h PMN NF-B活性低于对照组；两组患者在CPB开始30min后 PMN CD11b表达水平呈递增的趋势，CPB停止后30min、4h、24h 3个时间点上观察组PMN CD11b表达水平明显低于对照组。结论：同咪唑安定相比，异丙酚可以减低CPB患者PMN NF-B活性和CD11b表达，明显抑制体外循环患者炎症反应。 【关键词】 异丙酚； 心肺转流术； 中性粒细胞； 核因子BEffects of Propofol on NF-B Activity and CD1

3、1b Expression of Polymorphonuclear Neutrophils in Patients Undergoing Cardiopulmonary BypassAbstract： Objective： To study the effects of propofol on the NF-B activity and CD11b expression of polymorphonuclear neutrophils in cardiopulmonary bypass (CPB) patients. Method： Thirty ASA patients undergoin

4、g cardiac valve replacement surgery with CPB were randomly divided into two groups. Anesthesia was maintained with propofol in treatment group and with midazolam in control group. 3 milliliter radial artery blood was abstracted before induction of anesthesia, 30 min after CPB, 30 min, 4 hours and 24

5、 hours after CPB finish. NF-B activity was tested in electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and expression of CD11b was measured in flow cytometry. The differences between the two groups at different five time points, including were analyzed with Chi-square test and t-test. Result： The peak val

6、ue of NF-B activity was got 30 min after CPB. The NF-B activity in treatment group was lower than that in control group 30 min after CPB, 30 min, 4 hours and 24 hours after CPB finish. Expression of CD11b showed a progressive rise in two groups at all the 5 time points in the study. The CD11b expres

7、sion in treatment group was lower than that in control group on 30 min, 4 hours and 24 hours after CPB finish. Conclusion： Compared with traditional anesthesia with midazolam, propfol can reduce the activity of NK-B and expression of CD11b and inhibit inflammatory reaction during CPB.Key words: Prop

8、ofol; Cardiopulmonary bypass; Polymorphonuclear neutrophils; NF-B 心肺转流术（cardiopulmonary bypass，CPB）可触发一系列全身急性炎症反应（SIR），核因子B（nuclear factor-B，NF-B）是多种细胞因子和炎症介质的基因转录和级联放大过程的共同通路和作用位点，该基因序列的活化可加重CPB及心脏缺血再灌注损伤中的炎症反应程度1。中性粒细胞（PMN）与血管内皮细胞粘附、易位进入炎症区域是PMN发挥其炎症介导及损伤作用的关键步骤，其中PMN表面特异性的CD11b抗原是内皮细胞ICAM-1唯一的结合配

9、体。近年来的研究表明，异丙酚可以通过影响PMN的效应作用、促/抗炎细胞因子水平、氧自由基和一氧化氮的产生等炎性反应多个环节来防止过度失控的全身炎性反应的发生2。本项研究拟通过比较不同麻醉维持方法的CPB患者PMN NF-B和CD11b的表达差异，探讨异丙酚影响CPB引起的全身急性炎症反应的可能机制及其在CPB中应用的优点。1 材料与方法1.1 一般资料：选取本院风湿性心脏病于CPB下行心瓣膜置换术病例30例，ASA体格分级级，剔除术前有风湿活动者，及合并冠心病、糖尿病、肝肾功能不全、呼吸系统疾病或感染性疾病，所有病例术前半年均未使用糖皮质激素。随机分成观察组（异丙酚组）和对照组（咪唑安定组）各

10、15例，两组患者性别、年龄、体表面积、体外循环控制及主动脉阻断时间（>30min）差异无统计学意义（P>0.05，见表1）。表1 两组CPB患者一般资料的比较略1.2 麻醉方法：麻醉前30min肌注吗啡0.1mg/kg、东莨菪碱510g/kg。依次静脉注推咪唑安定0.050.1mg/kg，芬太尼510g/kg，维库溴铵0.1mg/kg进行麻醉诱导；气管插管后，使用Drager麻醉机机械通气（潮气量810ml/kg，呼吸频率12次/min），维持动脉二氧化碳分压3540mmHg。麻醉维持以吸入异氟醚、间断静脉注射维库溴铵为主。分别于切皮前、CPB前追加芬太尼1015g

11、/kg，芬太尼总量达3040g/kg，CPB前停异氟醚。观察组于CPB前静脉注射异丙酚l mg/kg后，以46mg/ 持续泵入，开放主动脉后改为3mg/维持至CPB结束。对照组CPB期间予咪唑安定0.10.2mg/kg，氟哌利多0.10.2mg/kg。应用SarnsTM8000体外循环机，美国产成人型膜式氧合器，预充量为1800 ml。转流中氧浓度为65%70%，非搏动性灌注，维持红细胞压积（Hct）25%30%，鼻咽温2628，灌注流量80l00mL/(kg·min)，维持平均动脉压5080mmHg。阻断升主动脉同时经主动脉根部灌注4晶体停跳液1015ml/kg，以后间隔30min

12、灌注冷血停跳液10ml/kg，维持心电呈等电位线。1.3 标本采集和测定：分别在麻醉前（T1）、CPB开始后30min（T2）、CPB停止后30min（T3）、4h（T4）、24h（T5）从桡动脉无菌采3ml抗凝血备用。1.3.1 PMN NF-B活性测定：用抗凝血2.5ml按以下步骤进行：PMN的分离：采用密度梯度离心法分离PMN。台盼蓝拒染实验检查细胞活力，结果纯度>98%，存活率>95%。用无血清改良Eagles培养液(DMEM)悬浮PMN，配制PMN工作悬液1.0×109/ml。分离的PMN立即放入4冰箱保存。细胞核蛋白的提取3：将分离的PMN用4

13、0.1mol PBS液冲洗并离心，沉淀悬浮于200L 4裂解液（20mM HEPES pH7.9，10mM KCI, 0.1mM NaVanadate，1 mM EDTA, 10% Glycerol , 1 mM DTT，1 mM PMSF），研磨、离心后沉淀，并重复一次以上步骤，得到纯净的细胞核。沉淀悬浮于200L 4裂解液（20mM HEPES pH7.9，10mM KCI，0.1mM NaVanadate，1mM EDTA， 20% Glycerol，0.42M NaCl, 1mM DTT，1 mM PMSF），离心取上清液，改良酚试剂法测定蛋白浓度，分装，-80保存。序列寡核苷酸的同位

14、素标记：采用末端标记法将NF-B的DNA结合位点（5-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3，3-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5）标记-32PATP。用乙醇沉淀法去除未标记寡核苷酸探针。Gel Shift Assay：将核蛋白提取物与同位素标记的寡核苷酸探针室温下共同孵育30min，加1L10×点样缓冲液，经4%非变性聚丙烯酞胺凝胶恒压电泳分离蛋白，剥离凝胶置真空干胶仪干燥，压片，-80放射自显影72h。冲洗X光片，灰度扫描，以积分灰度值表示NF-B的活性变化。1.3.2 用抗凝血0.5ml，采用流式细胞仪测定PMN CD11b

15、的表达水平，结果用平均荧光强度（MFI）表示。1.4 统计学方法：所有数据录入SAS8.0软件包，以计量资料采用均数±标准差（±s）表示，采用X2检验和t检验进行组间差异的统计学分析，以P<0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1 不同时间点两组CPB患者PMN NF-B活性的比较：如表2所示，两组患者PMN NF-B活性在CPB停止后30min达到峰值，观察组在CPB开始后30min、CPB停止后30min、4h、24h PMN NF-B活性低于对照组，差异有统计学意义。表2 不同时间点两组CPB患者PMN NF-B活性比较（略）2.2 不同时间点两组C

16、PB患者PMN CD11b表达水平的比较：如表3所示，两组患者在CPB开始后30min、CPB停止后30min、4h、24h PMN CD11b表达水平呈递增的趋势，CPB停止后30min、4h、24h 3个时间点上观察组PMN CD11b表达水平明显低于对照组，差异有统计学意义。表3 不同时间点两组CPB患者PMN CD11b表达水平的比较（略）3 讨 论体外循环心肺转流（CPB）过程中，血液与循环管道等异物的直接接触、CPB本身的非生理性灌注、手术创伤、肠道屏障功能的削弱、缺血再灌注损伤等均可触发一系列急性炎症反应，与术后并发症如呼吸衰竭、肾功能衰竭、凝血异常、多脏器功能衰竭的发生、发展密

17、切相关。体外循环炎症反应的病理生理过程中产生的重要的细胞因子有IL-1、IL-2、IL-8、IL-10、TNF-、NO等，这些物质可作用于IB蛋白激酶（IKK），影响IB-的磷酸化降解，加速NF-B的活化；NF-B活化后易位入核又通过诱导靶基因，加快这些炎性因子的转录4。因此NF-B具有多向性调节功能，广泛参与多种细胞因子和炎症介质的基因转录和级联放大过程。我们的实验测定了两组不同麻醉方法的CPB患者PMN NF-B的表达活性，结果显示两组患者随着CPB的启动而PMN NF-B活性增高，并于CPB停止后30min达到表达峰值，说明CPB的启动后，促进PMN中的NF-B活化、转移入核。研究表明，

18、异丙酚可以减少PMN释放促炎性细胞因子IL-8、TNF-，同时增加抗炎性细胞因子IL-1Ra、 IL-10的产生，这些细胞因子可以调控NF-B的活化、转录过程，从而抑制NF-B的促炎作用2。同时，异丙酚因化学结构类似Vit E的苯酚结构而具有清除氧自由基的功能，对氧化应激反应中氧自由基介导的脂质过氧化，膜结构和膜流动性改变及细胞内Ca2+超载均具有阻断作用。异丙酚能抑制PMN产生氧自由基并能有效清除过氧亚硝基阴离子，对氧化应激所致的血管内皮的损伤具有良好的保护作用5。我们的实验显示，较之使用咪唑安定麻醉维持的对照组，异丙酚组在CPB开始后30min、CPB停止后30min、4h和24h这4个时

19、间点的NF-B活性均明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），表明比较传统麻醉用药咪唑安定，异丙酚可以减低CPB患者PMN NF-B的活性。血管内皮细胞与中性粒细胞粘附是炎症反应的最初现象，也是中性粒细胞移行到血管外发挥其炎症介导作用的首要步骤。研究证实，激活的白细胞如果不与血管内皮细胞形成粘附，其释放产物对内皮细胞的损伤只是短暂的、可逆的，只有当白细胞粘附到内皮细胞上后，其释放产物才能引起内皮细胞的严重损伤与脱落6。本实验通过检测CPB患者PMN CD11b的表达水平，结果显示CPB开始后30min、CPB停止后30min、4h、24h这4个时间点上，CD11b的表达水

20、平随着CPB的启动呈递增趋势。这也与临床所观察到的严重炎症反应多见于CPB术后448h一致。同时，我们通过比较使用异丙酚麻醉维持的观察组和咪唑安定麻醉维持的对照组两组之间PMN CD11b表达的差异，结果发现CPB停止后30min、4h和24h这3个时间点上，观察组CD11b的表达水平显著低于对照组，表明同咪唑安定相比，异丙酚可以减低CPB患者PMN CD11b的表达，减少PMN与内皮细胞的黏附。可能与异丙酚具有钙通道阻滞作用2，及其对炎性细胞因子作用网络的调节及清除氧自由基作用有关。CPB可导致中性粒细胞NF-B活性和整合素CD11b的表达增加。同咪唑安定相比，异丙酚可以减低中性粒细胞NF-B活性和整合素CD11b的表达，可能从减少中性粒细胞NF-B激活和减少与血管内皮细胞黏附这两个机制，调节CPB引发的全身急性炎症反应，因此更适于CPB麻醉维持。【参考文献】 1 尹光明,喻田,余志豪.核因子kappa B与体外循环炎性反应J.国外医学麻醉学与复苏分册,2004,25(6):353-356.2 高巨,曾邦雄.