生物选修三专题一：基因工程

1、生物选修三专题一基因工程1、 基因工程基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。2、 DNA重组技术的基本工具（1）“限制性核酸内切酶分子手术刀”来源：主要从原核生物中分离纯化而来（注：为什么存在于原核生物中：原核生物易受自然界外源DNA的入侵，限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，从而达到保护自身的目的。）种类：已经分离出大约4000种作用：1、识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列 2、使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，分成脱氧核糖和磷酸作用结果：形成两种末端：黏性末端或平末端常见的限制酶：EcoR

2、I（在G和A之间切割）被限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。SmaI（在G和C之间切割）当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 为什么限制酶不剪切自己的DNA：细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。（

3、2） “DNA连接酶分子缝合针”作用效果：把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来催化形成磷酸二酯键（即把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来）注：两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来，DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能连接单链DNA！两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：相同点：都缝合磷酸二酯键。区别：E·coliDNA连接酶来自大肠杆菌，只能连接黏性末端； T4DNA连接酶来自T4噬菌体，能连接黏性末端和平末端，但连接平末端效率较低与DNA聚合酶作用的异同相同点：作用实质：都能催化形成磷酸二酯

4、键 化学本质：都是蛋白质不同点：DNA聚合酶：不需要模板，在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，结果形成完整 的重组DNA分子，应用于基因工程。 DNA连接酶：需要模板，只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸 二酯键，结果形成DNA的一条链，应用于DNA复制。（3） “分子运输车”运载体作用：1）作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中 2）在受体细胞内对目的基因进行大量复制成为运载体的必要条件：1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3）具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。4）必须是安全的 ，对受体细胞无害。5）载体DNA 分子应大小适中，以

5、便于提取和操作载体的种类：细菌的质粒病毒：噬菌体衍生物、动植物病毒等。质粒：独立于细菌染色体（即拟核DNA）之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。有一至多个限制酶切个位点，供外源DNA插入其中。携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后在细胞中进行同步复制。在质粒DNA分子上有独特的标记基因（如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因）供重组DNA的鉴定和选择。（注：实际上在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。）例1、基因工程中，须使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶的识别序列和切点是GGATCC，限制酶的识别序列和切点是

6、GATC。根据图示判断下列操作正确的是( )A目的基因和质粒均用限制酶切割B目的基因和质粒均用限制酶切割C质粒用限制酶切割，目的基因用限制酶切割D质粒用限制酶切割，目的基因用限制酶切割答案：D例2、图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp 、BamH 、Mbo 、Sma 4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为CCGG、GGATCC、GATC、CCCGGG。请回答下列问题：（1）图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由连接。（2）若用限制酶Sma 完全切割图1中DNA片段，产生的末端是末端，其产物长度

7、为。（3）若图1中虚线方框内的碱基对被TA碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶Sma 完全切割，产物中共有种不同DNA片段。（4）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是。答案：（1）脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖（2）平537bp、790bp、661bp（3）4（4）BamH I 抗生素B同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向

8、连接3、基因工程的基本操作程序目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定3、 基因的结构相关概念：启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。4、 真核与原核生物基因结构的比较相同点：都是由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区。不同点：原核细胞基因的编码区是连续的；真核细胞的编码区是间隔的，不连续的。注：外显子：真核细

9、胞基因DNA中的编码序列，这些序列被转录成RNA并进而翻译为蛋白质。内含子：真核细胞基因DNA中的间插序列，这些序列被转录成RNA但随即被剪除而不翻译。 5、 目的基因：主要是指编码蛋白质基因，也可以是一些具有调控作用的因子。目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。6、目的基因的获取的方法从基因库中获取目的基因应用PCR技术扩增目的基因用化学方法直接人工合成目的基因（1） 从基因库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。基因文库中包含了一种生物

10、所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库。基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库。如：cDNA文库。基因组文库的建立方法：基因组文库和cDNA文库的主要区别：（2）应用PCR技术扩增目的基因定义：PCR是多聚酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，在短时间内大量扩增目的基因原理：DNA复制（DNA分子热变性（在9095 OC时，解旋，双链分开温度降低又结合成双链）因此，在PCR技术中不需要解旋酶（与复制不同之在处)仪器：PCR扩增仪（自动调控温度的仪器）a. DNA热变性（9095 OC)：双链DNA模板在热的作用下，氢键断裂形成单键DNAb.

11、复性或退火（5560 OC)：系统温度降低，引物结合到互补DNA链上，形成局部的双链DNAc. 延伸（7075 OC)：在Taq酶作用下，合成与模板互补的DNA子链，形成双链DNAd.重复a.b.c步骤每重复一次，目的基因增加一倍扩增为指数形式扩增(n为扩增循环的次数），在短时间内扩增大量目的基因。（3） 用化学方法直接人工合成目的基因原理：蛋白质氨基酸序列mRNA的核苷酸序列目的基因序列目的基因适用对象：基因比较小，核苷酸序列又已知思考：人工合成的目的基因是否具有完整基因结构的基因？答：不具有，缺少非编码区(启动子、终止子）和非编码序列（如内含子），要人工构建。7、基因表达载体的构建核心作用

12、：使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代。同时使目的基因能表达和发挥作用。组成：目的基因启动子：是RNA聚合酶识别和结合部位终止子：是使转录在需要的地方停止标记基因：是鉴别受体细胞中是否含有目的基因从而将含有目的基因的细胞筛选出来（注：不同受体细胞，目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建有所差异。8、将目的基因导入受体细胞转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程常见转化方法：（1）将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法（80%的转基因植物通过该法获得）花粉管通道法基因枪法（2）将目的基因导入动物细胞显微注射法。（3）将目的基因导入微生物细胞 感受态细胞法。

13、农杆菌转化法：能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物没有感染能力原理：利用农杆菌中的Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上的特点。花粉管通道法操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含目的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞特点：简便经济例：转基因抗虫棉基因枪法操作方法：利用压缩气体产生的动力 ，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。适用：单子叶植物（2）将目的基因导入动物细胞显微注射法。细胞类型：受精卵操作程序（右图）（3） 将目的基因导入微生物细胞 感受态细胞法微生物作受体细胞

14、原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少常用菌：大肠杆菌常用法：Ca2+处理获得感受态细胞过程：注：通过基因过程生产人的糖蛋白不可以大肠杆菌作为工程菌吗，可以用酵母菌作为工程菌原因：糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成，而内质网和高尔基体存在真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含这两种细胞器，而酵母菌为真核生物（真菌类）9、 目的基因的检测与鉴定检查是否成功（1）检测方法：分子杂交技术：DNA分子与DNA分子的之间杂交DNA分子与RNA分子的之间杂交蛋白质分子（抗原与抗体）之间杂交个体生物学水平的鉴定：抗虫、抗病结种实验，活性比较实验DNA分子杂交技术检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因基因探针：放射性同位素等标记的DNA分子如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因。DNA分子与RNA分子的之间杂交检测目的基因是否转录出了mRNA如果显示出杂交带，就表明待测样品目的基因已经转录。蛋白质分子（抗原与抗体）之间杂交检测目的基因是否翻译成蛋白质如果出现杂交带，就表明待测样品目的基因已经翻译成蛋白质。例3、德国科学家最近培育出一种可以生产乙肝疫苗的转基因胡萝卜,通过生吃或者榨汁食用,就可以达到接种疫苗的效果。下图为乙肝疫苗的转基因胡萝卜生产部分过程的示意图。 (1)获得含目的