锶磷灰石修复下颌骨缺损的实验研究

1、    锶磷灰石修复下颌骨缺损的实验研究        摘要目的用不同浓度的锶磷灰石（SrHAP）植入动物体内，观察该材料的生物学反应，为其临床应用作前期研究。方法将24只新西兰大白兔分为3组，双侧下颌角均造成6mm×12mm×4mm的缺损，用不同浓度（10，5，0）的含锶羟磷灰石块分别予以修复，术后1月，3月，6月时随机处死一组分别进行尸解、四环素荧光标记、定量组织学观察以评估其生物性能。结果锶磷灰石复合人工骨未引起感染和排斥反应，术后材料降解早，新生骨

2、大量进入材料间隙，其成骨量明显较纯羟基磷灰石为多，且统计学上有差异， 5%的锶磷灰石烧结体内新生骨成熟度较10者为高，但统计学上未显示出成骨量的差异，术后3月时锶磷灰石周边出现强而亮的黄色荧光环，术后6月时荧光环仍未消退。结论(1)锶磷灰石有良好的组织相容性、骨引导性及生物降解性，并具有一定程度的骨诱导性。(2)锶元素浓度并非是影响总成骨量的关键因素，总成骨量可能主要与生物降解的程度大小有关。(3)锶的存在不但提高了新骨的总生成量，而且延长了新骨生成的总体时间和高峰期。关键词锶磷灰石；生物降解；骨引导；新骨生成量中分类号R782.1文献标识码A文章编号1006-7248(2000)02-007

3、3-03Experimental Study of Mandibular Reconstruction With Sr-HAPLIAO Da-pengZHOU Zheng-yanGU Yun-fengCHEN De-min（Dept.of Oral & Maxillofacial Surgery, Gangquan Hospital, Shanghai Tiedao University,Shanghai 200065,China）AbstractObjectiveDifferent ration of Sr-HAP was implanted in animals to study

4、the bioreactions in order to prepare for the clinical applications in future.Methods24 rabbits were divided into 3 groups for study.Bone defect of 6×12×4mm was made at the mandibular angle of rabbits and Sr-HAP of different proportion(10%,5%,0%) was applied to repair the defect.One group o

5、f animals were killed at 1 month, 3 months, 6 months to evaluate the biologic capacity with anatomy, tetracycline fluorescent marker and ration histology.ResultsSr-HAP almost hadn't been rejected by hosts,and early after operation the new bone in the Sr-HAP was found with great quantities as the

6、 degradation of Sr-HAP much more than that in the pure HA,and the difference of bone quantity can be shown in statistics.New bone in 5% Sr-HAP looked more mature than those in 10% Sr-HAP with no statistic difference in quantity.Strong and bright fluorescent rings can be seen around Sr-HAP from the 3

7、 months to 6 months. Conclusion(1) Sr-HAP has a better biocompatibility,biodegradation than pure HA and an excellent osteoinductivity. (2) The ration of strontium isn't the key influencing the new bone quantity,total new bone quantity maybe associated with the degree of biodegradation. (3)The ex

8、istence of Sr-HAP improves the total new bone quantity and prolongs the period of new bone increasing.Key WordsSr-HAP; Biodegradation;Osteoinductivity; New Bone Quantity 羟磷灰石（HA）属于磷酸钙类材料，具有和骨组织相似的自然矿物结构, 占骨构成的60%70，有良好的化学稳定性和生物相容性及足够的抗压强度1，2，但其生物降解性差，在体内长期不被吸收，引导成骨作用受到限制，并可能成为种植体植入时的障碍,甚至影响尖牙的萌出3。锶作

9、为人体和某些动物体内一种必要的微量元素，曾被用于防龋和防治骨质疏松4。羟磷灰石Ca10(PO4)6(OH)2中的钙（Ca）能被锶（Sr）置换生成锶磷灰石Sr10(PO4)6(OH)2（简称Sr-HAP）。本研究通过Sr-HAP动物植入实验，采用大体观察、四环素荧光标记、定量组织学等方法对其生物性能进行定性和定量的分析，并与HA对比评价其骨形成能力。1材料与方法11实验材料试验组：含锶HA(锶含量分别为摩尔质量比5和10)对照组：(1) 纯HA；(2) 自身修复试样规格：多孔块状烧结体：内孔径140160m，孔率 50%左右 （种植试样均由上海生物材料研究测试中心提供）用车针将材料自行加工成6m

10、m×12mm×4mm块状，超声波清水洗涤，高温高压灭菌备用。12实验分组随机将24只新西兰大白兔分为3组，每组8只，每只兔子分别于左右下颌角使用咬骨钳造成6mm×12mm×4mm的缺损，然后分别植入（5、10、0）块状HA或仅靠自身修复，如表1所示。表1材料分配表 Tab.1Materials distribution动物（只）一侧 植入含锶块状HA（左）另一侧植入纯块状HA或自身修复（右）25纯210纯25自身修复210自身修复分别于1月、3月、6月随机处死一组进行观察。1.3植入手术新西兰大白兔用2.5%戊巴比妥钠（40-45mg/kg）经腹腔麻醉，

11、固定于兔头架，用75%酒精消毒术区皮肤2次，再用5%新洁尔灭酊消毒3次，然后铺巾，于下颌角处作一平行于其下颌缘的弧形切口（长度依据情况而定），深达骨面，掀瓣，钝分离咬肌，充分暴露下颌角，矩形切除6mm×12mm×4mm的骨块，预制成6mm×12mm×4mm的植入块（含5锶、含10锶或HA块）嵌入后靠软组织覆盖和摩擦力固定或自身修复，分层缝合关闭创面。术后肌注洁霉素0.2g/只，每日2次，连续3d。1.4四环素荧光标记法本方法只观察3、6月组。盐酸四环素钠4mg/kg于动物处死前1周肌注,1周后处死动物,取出标本用纯丙酮固定脱水3d,MMA包埋，烘箱中恒温

12、1周硬固后，用Leitz 1600锯式切片机切片,取厚度100m,二甲苯透明后，D.P.X封片，在AH-2 Olympus 万能显微镜下观察。 15定量组织学采用四川联合大学研制的MIAS2000型像分析仪,测量材料骨界面及材料内部单位测定面积内新骨面积。该系统包括可进行显微摄像的显微镜及与之相连的电子计算机处理硬件和配套的相关软件。每组中各不同材料分别取6张组织学切片（不包括自身修复组），将其置于显微镜下观察，每张切片随机选择4个测定区，通过交互式操作用鼠标定出测定区内新骨的轮廓5，计算机软件自动分析并测量出相应数据，经过统计学分析，得出最终结果。 2结果21一般情况及尸解术中因麻醉意外死亡

13、2只，后又补足2只，共24只实验用兔术后均健康，切口愈合良好，无感染破溃和异常分泌物。以耳静脉空气栓塞法处死动物，按原手术方式打开并暴露种植体，观察到对照组植入试样中有一只右侧植入体轻度颊侧移位，其余试样均与宿主骨结合牢固，材料周围均无纤维包膜包裹，自体修复组直至6个月时仍有明显骨缺损存在。22荧光显微镜观察术后3月：自身修复组在缺损边缘有少量荧光出现，并未成环；纯HA组在材料骨界面处出现散在的半环状荧光，材料内部未见明显荧光；5Sr-HAP组在材料骨界面处有高强度荧光带连接材料和骨组织，而在材料内部呈现大量明亮的黄色荧光环，紧密包绕材料，周边软组织内出现较为明亮的条带状荧光区；10Sr-HA

14、P组在材料骨界面处同样出现了明亮的荧光条带向材料内延伸，而在材料内部孔隙内有大量点状荧光，成环不规则，周边软组织内可见明显的荧光区。术后6月：自身修复组缺损边缘仍有少量成环不全的荧光；纯HA组材料骨界面荧光已极微弱，稀少而成环不全；5Sr-HAP组界面处仍有明亮的荧光带存在，而材料内部荧光环紧密包绕材料颗粒并向其内部侵入，将材料颗粒进一步分割，软组织内荧光区较3月时稍有减弱，但仍清晰可辨；10Sr-HAP组各部位表现基本同5组，但荧光环小而弱。23定量组织学结果采用单因素方差分析进行成组设计的多个样本均数比较，再用q检验进行多个样本均数间每两个均数的比较。经过统计，每一时间段内的3个不同浓度组

15、总体的新骨生成面积比均存在差异，故随后两两比较各不同浓度组，其q检验结果如表2所示。由表可知，术后1月，纯HA组与5Sr-HAP组或10Sr-HAP组新骨生成量均存在着显著差异，而5Sr-HAP组与10Sr-HAP组无明显差异，术后3月和6月也有同样趋势。表2 各时段不同浓度组两两比较的q检验Tab.2Test of different concentration group in each period1月组3月组6月组0510051005100%P<0.01P<0.01P<0.015%P>0.05P>0.05P>0.0510%P<0.01P<

16、0.01P<0.013讨论31Sr-HAP的生物特性术后各时段解剖均未发现植入体周有感染和异常分泌物，反映了SR-HAP良好的生物相容性，这与Sun 等在体外的细胞培养实验结果相符6。根据Christoffersen的报道，随着Sr替代Ca的摩尔质量比从1增加到10，SR-HAP的降解度也随之增加7，Okayama作了相似的体外实验，也认为SR-HAP 的降解度较纯HA为高8，但他们仅作了体外测试，不能充分说明Sr-HAP在生物体内的特性。本动物实验观察到术后36月，Sr-HAP材料中大量空间被明亮的荧光环所占据，表明随着Sr-HAP的降解，大量新生骨长入材料间隙，与材料紧密连接，显示了

17、Sr-HAP良好的骨引导性和生物降解性，而纯HA组在同一时间段仅能观察到材料骨界面处有少量成环不全的荧光，说明纯HA生物降解率低，不能为新生骨提供足够的生长空间，材料内部未见荧光出现,反映了纯HA的骨引导性较Sr-HAP差，骨组织不能长入材料的内部。而Sr-HAP周边软组织内出现较为明亮的荧光，表明它有一定程度的骨诱导性，能诱导软组织内的未分化细胞成软骨细胞和成骨细胞，进而生成软骨和骨。另外，我们发现Sr-HAP材料骨界面和材料内部的明亮的黄色荧光环从术后3月一直延续到6月，数量和强度无明显衰减，而纯HA组术后6月时较3月时材料骨界面和材料内部的荧光有明显减退，若延长实验周期至1年，可能会更明

18、显，但这也足以提示由于元素Sr的存在，不但提高了新骨的总体生成量，而且延长了新骨生成的高峰期，估计是元素Sr的释放刺激了周围骨细胞增生的结果。32锶含量与成骨量的关系根据定量组织学的结果，术后1月，3月，6月时纯HA组与5Sr-HAP组或10Sr-HAP组新骨生成量均存在着显著差异，推测出现这种结果有3个原因：(1)Sr-HAP良好的生物降解性为新骨的长入提供了充足的空间；(2)Sr-HAP良好的骨引导性使骨组织能顺利地进入材料的内部，长满材料的所有孔隙；(3)Sr-HAP一定程度的骨诱导性在材料骨界面和材料内部诱导产生了一定量的新骨。其中原因1起主要作用。该结果表明Sr-HAP在骨缺损修复方

19、面较纯HA有明显的优势。而5Sr-HAP组与10Sr-HAP组在所有时段内新骨生成量均无明显差异，由于这两种材料在组织学观察中具有相似的骨引导性，并都有一定程度的骨诱导性，所以，出现这种结果可以间接表明两者在生物体内有大致相当的生物降解率，这与Christoffersen的体外研究结果不完全相符7，对于这种体内体外不相符的情况，笔者有以下假设：由于体液和组织细胞内均有一定含量的Sr存在，且组织细胞对特定元素的需求有选择性，当Sr-HAP中的Sr浓度达到一临界值时，便与生物体内的Sr的交换形成一个动态平衡，再增加浓度，也不会增大Sr-HAP的Sr元素的解离度，而且根据本实验结果推断，此临界值应该

20、在10以下。该假设是否成立，需要证明临界值的存在，尚需进一步研究。基金项目铁道部课题(1281 B96-45）作者简介廖大鹏（1975-），男,同济大学医学院研究生廖大鹏（同济大学医学院附属甘泉医院口腔科,上海200065）周正炎（同济大学医学院附属甘泉医院口腔科,上海200065）顾云峰（同济大学医学院附属甘泉医院口腔科,上海200065）陈德敏（上海生物材料研究测试中心,上海200011）参考文献1RedondLM, Garcia JM, Verrier A,et al. Effect of particulate porous hydroxyapatite on osteoinducti

21、on of demineralized bone autografts in experimental reconstruction of the rat mandibleJ. Int J Oral Maxillofac Surg,1995，24(6):445-4482Schliephake H, Neukam FW. Bone replacement with porous hydroxyapatite blocks and titanium screw implants:An experimental studyJ. J Oral Maxillofac Surg, 1991,49:151-1563翦新春,陈新群，王承兴.单侧唇腭裂中牙槽嵴裂的手术治疗J. 中华整