MSC体内外促组织修复试验方法

1、MSC勺组织修复作用在机体组织损伤修复过程中，MSC是一种重要的参与组织再生的细胞。在组织损伤引起的特殊信号作用下，MSC迁徙至损伤部位，在局部增殖，并依据不同的损伤信息而沿着不同的途径分化。MSC易于分离培养，体外增殖能力旺盛，因此，MSC是一种实用的组织修复种子细胞。目前关于MSC的组织再生功能有两种理论：其一，将体外扩增的M5c移植到组织损伤部位，在局部微环境作用下，定向分化为某一特定类型功能细胞，直接参与组织损伤修复过程；其二，移植于损伤部位的细胞，分泌多种生物活性物质，包括细胞趋化、生长、营养因子等，以改善组织损伤部位再生微循环，促进宿主组织中残存的干/祖细胞增殖分化，MSC间接参与

2、了组织修复过程。MSC改善组织再生微环境，表现为细胞所分泌的生物活性物质具备的多种功能，包括：（1）趋化周阔的宿主干/祖细胞迁徙至损伤那位；（2）促进干/祖细胞的增殖分化；（3）抑制受损伤功能细胞的凋亡；（4）促进毛细血管新生；（5）激活周围细胞金属硫蛋白酶活性，抑制瘢痕形成；（6）调节免疫细胞功能，抑制炎性反应。目前，关于MSCfi织再生功能的检测还没有一个明确的标准。在体外检测中，只能通过检测MSO化为受损组织细胞的能力和MSO泌修复组织损伤有关细胞因子、抗炎因子、营养因子等来鉴定MSC勺组织再生功能，这是判定MSCfi织再生功能的基础，但是这样的评判也存在很大缺陷的，MSC体外的培养环境

3、和在体内微环境中存在很大差别，微环境下细胞之间的接触作用，损伤细胞释放的因子对MSC勺刺激作用和趋化彳用等可能都对MSO泌的细胞因子种类和剂量有影响。因此，通过在各种适应症模型治疗时，对MSCE微环境中的组织再生功能的相关指标进行检测是必要的。体外试验：一、检测MSO化为受损组织细胞的能力：体外诱导MSO化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、胰岛3细胞、神经细胞、肝细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、肌肉细胞、脊髓基质细胞等。二、检测MSO泌修复组织损伤相关因子：1、促血管生成因子检测：PCRELISA检测UC-MSCi体外是否分泌HGFVEGFbFGRTGF-31的因子。2、抗炎性因子检测：PCRELI

4、SA检测UC-MSCi体外是否分泌IL-10、bFGFTGF-”、IDO。3、促细胞分裂增殖的因子检测：PC址ELISA检测UC-MS窿体外是否分泌HGF、bFGF、IGF-1、GM-CSFEGFPDGF4、抗细胞凋亡作用：PCRELISA检测MSB否分泌IGF-1、SDF-1a、VEGF5、趋化作用：PCRELISA检测MSC否分泌SDF-1（CXCR4、IL-6、IL-8、CXCMCP-1.。体内试验：MSC台疗肝硬化模型、MSC台疗肾损彳模型、MSC啰复坏死胰腺组织、MSC用于心血管疾病的治疗、MSCffi于肺纤维化模型等MSC治疗肝硬化模型在CCl4诱导的肝硬化模型中，MSC通过抑制肝

5、脏胶原合成、诱导肝脏内源干细胞的分化增殖、抑制CCl4引起的肝损伤和炎症、促进肝脏血管再生等作用来改善肝脏病变状况。检测指标包括：1、MSC抑制胶原合成作用：肝病变部位胶原的含量2、促细胞生长作用：HGFT、bFGF（成纤维细胞生长因子）T、PDGF（血小板衍生因子）3、纤维化逆转作用：组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP-1）J、TGF3J的表达4、炎性和抗炎性因子检测：IL6J、TNEoU、INF-yJ、IL-13J、一氧化氮合酶J、IL-10T、bFGFT、TGF-af、Bcl-2T,MSC的抗炎性作用还表现在抑制T细胞、NK细胞、B细胞的增殖和抑制中性粒细胞产生H2O2。5、促血管生成作用：

6、HGF（肝细胞生长因子）T、VEGF（血管内皮生长因子）T、TGF-1（转化生长因子）T、bFGF（成纤维细胞生长因子）T、PDGF（血小板衍生因子）T、内皮素（endothelin）T、表皮调节蛋白（epiregulin）T等。6、检测输注阳性标记MS%受损组织中是否存在。7、观察受损组织的外观、质地与对照组相比是否有恢复的趋势。8、观察统计治疗组与对照组动物的精神状态或存活状态。9、组织切片观察治疗组受损组织结构、功能细胞分布是否趋于正常。10、检测受损组织的功能是否有所改善。11、病理切片观察受损组织周围炎性细胞情况，检测炎性因子分泌情况。12、受损组织中趋化因子SDF-1T、IL-8T

7、、CXCT、MCP-1T（单核趋化蛋白）等的含量。MSC治疗肾损伤模型在急性肾损伤、慢性肾损伤等动物模型中，MSC通过诱导肾脏内源干细胞的分化增殖、肾小管上皮细胞增殖、抑制肾脏损伤和炎症、促进肾脏血管再生等作用改善肾脏功能。检测指标包括：1、促细胞生长作用：HGFT、bFGF（成纤维细胞生长因子）T、PDGF（血小板衍生因子）T2、炎性和抗炎性因子检测：IL-6，、TNF-a，、INF-丫，、IL-1、一氧化氮合酶，、IL-10T、bFGFT、TGF-af、Bcl-2T,MSC的抗炎性作用还表现在抑制T细胞、NK细胞、B细胞的增殖和抑制中性粒细胞产生H2O2。3、促血管生成作用：HGF（肝细胞

8、生长因子）T、VEGR血管内皮生长因子）T、TGF-1（转化生长因子）T、bFGF（成纤维细胞生长因子）"PDGF（血小板衍生因子）T、内皮素（endothelin）T、表皮调节蛋白（epiregulin）T等。4、检测输注阳性标记MSCB受损组织中是否存在。5、观察受损组织的外观、质地与对照组相比是否有恢复的趋势。6、观察统计治疗组与对照组动物的精神状态或存活状态。7、组织切片观察治疗组受损组织结构、功能细胞分布是否趋于正常。8、检测受损组织的功能是否有所改善。9、病理切片观察受损组织周围炎性细胞情况，检测炎性因子分泌情况。10、受损组织中趋化因子IL-8、CXC、MCP-1（单核

9、趋化蛋白）的含量。MSC修复坏死胰腺组织造模：处理胰腺组织，造胰腺组织坏死模型：开腹结扎胰腺组织，7-8小时后，胰尾局部组织变黑坏死，周围有炎性细胞浸润。治疗：在胰腺未损伤部位植入胰腺DAPI标记的胰腺MSC细胞。检测指标：1、观察胰腺组织外观是否趋于正常，切片胰岛细胞是否趋于正常；2、DAPI标记的阳性MSC在胰腺组织是否存在，数量多少；3、治疗组和未治疗组的动物精神状态和成活率对比；4、观察受损组织的外观、质地与对照组相比是否有恢复的趋势。5、组织切片观察治疗组受损组织结构、功能细胞分布是否趋于正常。6、检测受损组织的功能是否有所改善。7、病理切片观察受损组织周围炎性细胞情况，检测炎性因子

10、分泌情况。8、受损组织中趋化因子SDF1T、IL-8T、CXCT、MCP-1T（单核趋化蛋白）的含量。9、促细胞生长作用：HGF、bFGF（成纤维细胞生长因子）3PDGF（血小板衍生因子）T10、炎性和抗炎性因子检测：IL-6J、TNF-aJ、INF-丫J、IL-13J、一氧化氮合酶J、IL-10T、bFGFT、TGF-af、Bcl-2T,MSC的抗炎性作用还表现在抑制T细胞、NK细胞、B细胞的增殖和抑制中性粒细胞产生H2O2。11、促血管生成作用：HGF（肝细胞生长因子）T、VEGF血管内皮生长因子）T、TGF-1（转化生长因子）T、bFGF（成纤维细胞生长因子）T、PDGF（血小板衍生因子

11、）T、内皮素（endothelin）T、表皮调节蛋白（epiregulin）T等。MSC用于心血管疾病的治疗在心肌梗塞、心肌缺血性损伤等模型中，MSC的治疗作用表现为保护心肌细胞、促进心脏祖细胞的分化增殖、抑制心脏炎症反应、促进心脏血管生成，促进神经细胞再生、改善心脏功能。检测指标包括：1、观察心脏组织外观是否趋于正常，切片心肌细胞是否趋于正常；2、移植阳性MSC在心脏受损部位是否存在，数量多少；3、治疗组和未治疗组的动物精神状态和成活率对比；4、观察受损组织的外观、质地与对照组相比是否有恢复的趋势。5、组织切片观察治疗组受损心脏组织结构、功能细胞分布是否趋于正常。6、检测受损心脏组织的功能是

12、否有所改善。检测神经前体细胞（NPC）的增殖胶质纤维酸性蛋白（GFAP的表达。7、病理切片观察受损心脏组织周围炎性细胞情况，检测炎性因子分泌情况。8、受损组织中趋化因子IL-8、CXC、MCP-1（单核趋化蛋白）的含量。9、促细胞生长作用：HGF、bFGF（成纤维细胞生长因子）3PDGF（血小板衍生因子）T、IGF-110、炎性和抗炎性因子检测：IL-6J、TNF-aJ、INF-丫J、IL-13J、一氧化氮合酶J、IL-10T、bFGFT、TGF-af、Bcl-2T,MSC移植可以减少心肌层CD68+T细胞的增加和减少单核细胞趋化蛋白（MCP-1）的表达。11、促血管生成检测：HGF（肝细胞生

13、长因子）T、VEGF血管内皮生长因子）T、TGF-1（转化生长因子）T、bFGF（成纤维细胞生长因子）3PDGF（血小板衍生因子）T、内皮素（endothelin）T、表皮调节蛋白（epiregulin）T等。12、造血因子分泌检测：IL-8、GM-CSRM-CSF、TNF-“等。13、神经营养因子分泌检测：IGF-1、BDNF、GDNRNGF、TIMP-1等。MSC用于肺纤维化模型在博来霉素诱导的肺纤维化模型中，MSC移植可以抑制肺纤维化，同时MSC产生IL-1受体拮抗剂（一种抗炎性的可溶性因子），减轻博来霉素导致的肺损伤。虽然有一些实验证据，但是目前MSC抑制肺脏纤维化还有争议。检测指标：

14、1、MSC抑制胶原合成作用：肺病变部位胶原的含量2、促细胞生长作用：HGF、bFGF（成纤维细胞生长因子）T、PDGF（血小板衍生因子）3、纤维化逆转作用：组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP-1）J、TGF3J的表达4、炎性和抗炎性因子检测：IL6J、TNEoU、INF-yJ、IL-13J、一氧化氮合酶J、IL-10T、bFGFT、TGF-aT、Bcl-2T,MSC的抗炎性作用还表现在抑制T细胞、NK细胞、B细胞的增殖和抑制中性粒细胞产生H2O2。5、促血管生成作用：HGF（肝细胞生长因子）T、VEGF（血管内皮生长因子）T、TGF-1（转化生长因子）T、bFGF（成纤维细胞生长因子）T、PDGF（血小板衍生因子）T、内皮素（endothelin）