海洋酵母普鲁兰类酵母碱性蛋白酶发酵生产_特性研究及基因克隆_

1、第二章海洋酵母普鲁兰类酵母A. pullulans 10固体发酵生产碱性蛋白酶的研究1 前言固体发酵的特殊性及其特殊产物往往是液体发酵无法取代的,如风味绝佳的粮食酒和我们日常饮食中不可缺少的酱油依然得依赖固体发酵才能酿造。固体发酵与液体发酵相比有培养基简单、成本低、处理简单、工业用水少、酶浓度高等优点,食品、饲料、皮革等许多行业对蛋白酶的纯度要求低或可以直接利用,因此固体发酵产蛋白酶或蛋白酶水解产物受到人们广泛重视。普鲁兰类酵母(Aureobasidium pullulans在分类学上,介于酵母和霉菌之间,能以三种形态存在,既可以以单细胞存在,也能产假菌丝和真菌丝,在固体发酵时,深入到固体培养

2、基中利用其中的营养成分,其产生的胞外蛋白酶更能酶解培养基中固态蛋白促进其溶解和生成多种短肽和氨基酸。关于海洋酵母,一直以来,大家都对它们的分布和种类比较感兴趣(Goto et al., 1974;Fell 1976;Yamasato et al., 1974; Gadanho et al., 2003,而对其在固体发酵中的应用研究则极少。分离自海泥的海洋酵母A. pullulans 10能在液体发酵中产蛋白酶(Chi et al., 2007,在蛋白酶的实际应用中,如食品饲料等行业所用到的蛋白酶是不需要纯化和浓缩的粗酶,因此固体发酵所产蛋白酶可满足这些行业的需求。本章节我们研究讨论了海洋酵母普

3、鲁兰类酵母A. pullulans10固体发酵生产蛋白酶的情况。微生物发酵生产蛋白酶过程中,培养基成分(碳源、氮源、含水量、金属离子等和培养条件(pH、温度、通气、接种对于发酵后蛋白酶的产量和发酵液组分影响非常大(Barranco-Florido, 2002;Elibol and Moreira, 2005; Uyar and Baysal, 2004,因此进行固体发酵时,需要选择合适的发酵原料和发酵条件。2 材料和方法2.1材料海洋酵母普鲁兰类酵母Aureobasidium pullulans 10,由本实验室自海泥中分离并鉴定保存。YPD液体培养基(g/L:葡萄糖 20.0,蛋白胨20.0

4、,酵母粉 10.0。115 C高温灭菌30min。YPD平板:YPD液体培养基中每100mL加入2g琼脂粉,115 C高温灭菌30min,倒入无菌平板中,冷却,4 C 保存待用。固体发酵培养基:250mL三角瓶加入5g豆饼粉或麦麸或稻糠,将2%硝酸钠溶液调至需要的pH,按一定的含水量加入三角瓶中,搅拌均匀,121 C高温灭菌20min。称取0.5g酪蛋白,加入约50mL蒸馏水,70-80C水浴,边搅拌边慢慢加入0.1%氢氧化钠促进酪蛋白的溶解(pH控制在7.0-8.0,直至酪蛋白完全溶解,冷却后加入10mL 0.5M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0,并加水至100mL,-20C 保存。于2

5、000mL磨口回流装置内加入钨酸钠(Na2WO42H2O100g,钼酸钠( Na2MO42H2O 25g,水700mL,85%磷酸50 mL,浓盐酸100 mL,微火回流10 h后,加入硫酸锂150g,蒸馏水50 mL和溴数滴,摇匀,煮沸15min,以驱除残溴,溶液呈黄色,冷却后定容至1000mL。过滤,置于棕色瓶中。使用时,稀释两倍。2.2方法将普鲁兰类酵母10在YPD平板上划线,28C培养,72h后挑取单菌落接入YPD液体培养基中,培养过夜,作为固体发酵的种子液,测定种子液的OD600nm。计算种子液中细胞浓度(1 OD600nm=107cells/mL,以每克干固体发酵培养基107个酵母

6、细胞浓度接入固体发酵培养基中,28C培养箱中培养,培养期间,平均每6 h 将三角瓶中培养基和菌体摇匀一次。发酵结束后,将发酵瓶中加入50mL蒸馏水,4C左右震荡1h,使固体基质中蛋白酶溶解于水中(Aikat and Bhattacharyya, 2000; Tunga et al.,1999,4 C, 2500g 离心5min,取上清液测定蛋白酶活。蛋白酶酶活的定量测定方法有很多,我们选用的是以酪蛋白为底物,用Folin-酚与所生成的酪氨酸反应显色,通过测定吸光度来测定蛋白酶酶活。离心5min,取上蛋白酶水解酪蛋白反应:发酵结束后,取发酵液4 5000g清0.5mL,与1.0mL 0.5%的酪

7、蛋白底物(0.05M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制, pH 9.0混合,45C水浴,30min后迅速加入2 mL 10% TCA(三氯乙酸终止反应。对照管中,2 mL 10% TCA加入的时间是在加底物之前。酪氨酸浓度测定:酶反应结束后,10000g离心10min,取上清,其中的酪氨酸浓度用Folin-酚法(Lowry et al. 1951,取三只试管,分别加入1mL测定组上清、1mL对照组上清1mL蒸馏水,每管加入0.55 M碳酸氢钠5mL,混匀后,加入Folin-酚试剂1mL,立即混匀,30C显色15min,以加蒸馏水的试管作空白, 650nm出测定测定组和对照组的吸光值OD650nm。酶活

8、单位的定义:U表示每min产生1g酪氨酸所需酶量。固体发酵酶活表示:称取与发酵培养基同样重量的豆饼粉或麦麸或稻糠,放置100C烘至恒重,酶活用每克干培养基所得到的蛋白酶活表示。3 结果和讨论3.1固体发酵培养基的优化实验过程中选取了豆饼粉、麦麸和稻糠作为固体发酵培养基的主要原料,自然pH,含水量60%,灭菌后,接入种子液,4天后,测定其蛋白酶酶活,结果如表2-1前三项所示,其中使用豆饼粉的效果最好,原因可能是豆饼粉中所含蛋白能诱导菌株蛋白酶的产生。表2-1不同培养基对产酶的影响Table 2-1 Effect of medium on alkaline protease production培

9、养基(g/250mL三角瓶酶活(U/g干培养基豆饼粉(5 94.42.3麦麸(5 28.91.5稻糠(5 3.332.4豆饼粉+稻糠(2.5+2.5 62.23.9豆饼粉+稻糠(3+2 86.15.2豆饼粉+稻糠(3.5+1.5 94.46.1豆饼粉+稻糠(4+1 125.63.4豆饼粉+稻糠(4.5+0.5 100.94.3 豆饼粉比较密实,灭菌后容易结块,从而影响培养基的通气,一定程度可能影响发酵产酶,因此实验中又将豆饼粉和稻糠以不同比例混合后作为培养基,研究其产蛋白酶情况,结果见表2-1,从结果中可以发现加入少量的稻糠能促进蛋白酶的产生,酶活提高了33%。因此我们选用了豆饼粉和稻糠4:1

10、比例混合作为我们用普鲁兰类酵母A. pullulans10进行固体发酵产蛋白酶的主要原料,并以此为基础优化其它发酵条件。在我们以往对普鲁兰类酵母A. pullulans10液体发酵法生产碱性蛋白酶的研究中发现,无机氮源中加入一定量的硝酸钠对产蛋白酶有一定的促进作用(Chi etal. 2007,因此我们在研究A. pullulans10固体发酵时,也对硝酸钠对产酶的影响作了探讨。配制不同浓度的硝酸钠溶液,以60%的含水量加入到豆饼粉和稻糠的混合物中,灭菌,接种,28C培养,4天后测定其产酶情况结果如图2-1所示。从图中可以看出加入一定量的硝酸钠能促进产酶,并且浓度在2%左右时最佳,酶活达145

11、U/g培养基。 图2-1硝酸钠对产酶的影响Fig. 2-1 Effect of sodium nitrate concentration on alkaline protease production 图2-2含水量对产酶的影响Fig. 2-2 Effect of moisture content(%,w/v on alkaline protease production固体发酵过程中控制其合适的含水量是发酵成功的重要因素,含水量太多或太少都不利于固体发酵产酶。由于不同批次培养基原料中水分含量会有变化,并且发酵过程中由于环境湿度的不同水分也会有不同程度的蒸发,因此初始培养基的含水量和发酵过程中

12、的含水量控制是非常重要的,大多工厂的技术人员是通过经验和中间补水等方法控制固体发酵的含水量。我们在进行固体发酵含水量的研究时,培养基的原料为同一批豆饼粉和稻糠,发酵过程中将培养箱保持在一定的湿度,在此条件下探讨了培养基的初始含水量对固体发酵产碱性蛋白酶的影响,结果如图2-2所示,含水量在50%时产酶最高,酶活达到149U/g干培养基。培养基中含水量低导致产酶不高的原因应是不能满足酵母菌生长对水分的基本要求,从而影响产酶;培养基含水量太高,产酶降低的原因则可能是:水分过多能改变培养基颗粒的形状、减少培养基颗粒间的孔隙,减少了空气流量,影响氧气的溶解和扩散(Nigam, 1990,从而影响蛋白酶的

13、产生。3.2固体发酵培养条件的优化固体发酵与液体发酵相比较,整个发酵培养基的物质交流和菌体分散相对不充分,因此初始的接种量可能对于最终产酶会有影响。图2-3是初始接种时,每克干培养基接入酵母数量对最终蛋白酶产量的影响,结果在接种量为107cells/g 干培养基的时候产酶最高。 图2-3初始接种量对产酶的影响Fig.2-3 Effect of inoculating cell quantity on alkaline protease production固体发酵时培养基的厚度影响发酵时的物质的交流、通气和发酵热能的去除,要得到产酶总量最高则需要即要在一定的发酵容器中所加培养基尽量多,又要单位

14、培养基产酶高,因此在进行固体发酵中需要控制合适的培养基厚度,通常在4cm左右。我们在实验室中考察了250mL三角瓶中培养基装量对最终产酶的影响。250mL三角瓶中分别装2.5g、5 g 、7.5g、10g、15g的培养基培养基,厚度分别在0.5 cm、1.5 cm、2.5 cm、5 cm、7cm左右,结果如图2-4所示。在装5 g 、7.5g和10g培养基时单位培养基产酶相近,因此,发酵时选10g/250mL三角瓶的装量(厚度约5cm。 图2-4装量对产酶的影响Fig. 2-3 Effect of quantity of medium in 250 mL flask on alkaline p

15、rotease production无论是液体发酵还是固体发酵,pH和温度对发酵的结果影响都很大。图2-5和2-6分别是初始pH和温度对普鲁兰类酵母A. pullulans10固体发酵生产碱性蛋白酶的影响,从图中可看出,在碱性条件下要比在酸性条件下产酶更高,最适pH和温度分别是10.0和28C。固体发酵时间的长短主要取决于菌体的生长速度,一些固体发酵生产碱性蛋白酶的研究中,细菌和真菌的发酵结束时间相差很多,从2天到8、9天时间不等(Aikat and Bhattacharyya , 2000; Puri et al., 2002。普鲁兰类酵母A. pullulans 10菌株在优化的培养基和培

16、养条件下,培养不同的时间测定蛋白酶活性,结果如图2-7所示。从图中可以看出三天后,蛋白酶活达到最高,酶活可达到196.9U/g 干培养基。 图2-5 pH对产酶的影响Fig. 2-5 Effect of pH on the alkaline protease production 图2-6温度对产酶的影响Fig. 2-76Effect of growing temperature on alkaline protease production 图2-7条件优化后酶活曲线Fig.2-7 Effect of incubation time on alkaline protease producti

17、on4 本章小结1优化了普鲁兰类酵母A. pullulans10固体发酵生产蛋白酶培养基主要成分,在豆饼粉和稻糠以4:1比例时,蛋白酶活最高,含水量在50%时,酶活最高。添加2 % 硝酸钠溶液可在一定程度上提高蛋白酶活。2优化了普鲁兰类酵母A. pullulans10固体发酵生产蛋白酶发酵条件,最佳接种量是107cells/g培养基;装量在10g/250mL三角瓶时所产蛋白酶总量最高;最适温度28C,最适初始pH 10.0。3在优化的培养基和发酵条件下,普鲁兰类酵母A. pullulans10发酵培养基3天后酶活达到最高,为196.9 U/g干培养基。第三章海洋酵母普鲁兰类酵母A. pullu

18、lans10液体发酵生产蛋白酶及酶的分离纯化和特性研究1 前言以蛋白质的结构与功能为基础,从分子水平上认识生命现象,已经成为现代生物学发展的主要方向。研究酶蛋白的性质和应用,首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的蛋白。酶蛋白的分离纯化工作涉及物理、化学和生物等各方面知识,但基本原理不外乎两方面。一是利用蛋白混合物中组分在物相中分配率的差别,把它们分配到两个或几个物相中,如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等;二是将混合物在单一物相中,通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离目的,如电泳、超速离心、超滤等。在所有这些方法的应用中必须每一步都注意生物大分子的完整性,防止酸、碱、高温、剧烈机械作用导致目的蛋白生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下几个阶段:含有目的蛋白混合物的大量制备、浓缩、纯化、纯度鉴定、干燥和保存。根据不同蛋白物理化学性质的不同可采用的纯化方法有很多,如蛋白分子的大小、形状的不同可采用凝胶层析法;电荷不同,可用离子交换层析法等,这两种方法使用较多(Marshak 1976; Kamp 1997。凝胶层析法:当蛋白质混合样品通过层析柱时,分子量不同的各组分在柱中受到固定相(凝胶的阻滞作用