酶工程03-动植物细胞培养产酶

1、酶工程03-动植物细胞培养产酶l概述概述动物细胞动物细胞l无细胞壁，容易贴壁无细胞壁，容易贴壁l对营养要求严格（血清培养基）对营养要求严格（血清培养基）l对环境敏感（对环境敏感（pH、溶氧、温度、剪切应力）、溶氧、温度、剪切应力）植物细胞植物细胞l有细胞壁，但比微生物的细胞壁脆弱有细胞壁，但比微生物的细胞壁脆弱l营养要求较动物细胞简单营养要求较动物细胞简单l生长缓慢，培养周期长，要达到高密度较困难生长缓慢，培养周期长，要达到高密度较困难特征特征哺乳动物细胞哺乳动物细胞植物细胞植物细胞微生物细胞微生物细胞大小大小 ( m)1010010100110生长形式生长形式悬浮、贴壁悬浮、贴壁悬浮悬浮悬浮

2、悬浮营养要求营养要求很复杂很复杂很复杂很复杂简单简单倍增时间倍增时间 (h55细胞分化细胞分化有有有限分化有限分化无无环境影响环境影响非常敏感非常敏感敏感敏感一般一般产物存在部位产物存在部位胞内或胞外胞内或胞外胞内或胞外胞内或胞外胞内或胞外胞内或胞外产物浓度产物浓度低低低低高高供氧需求供氧需求 (KLa)12520301001000产物种类产物种类疫苗、单抗、酶、疫苗、单抗、酶、生长因子、激素等生长因子、激素等天然色素、天然天然色素、天然有机化合物等有机化合物等抗生素、有机抗生素、有机小分子、酶等小分子、酶等l概述概述植物细胞与动物细胞、微生物细胞培养的比较植物细胞与

3、动物细胞、微生物细胞培养的比较l概述概述植物细胞与动物细胞、微生物细胞培养的比植物细胞与动物细胞、微生物细胞培养的比较较l动物细胞、植物细胞和微生物细胞可以用相同方动物细胞、植物细胞和微生物细胞可以用相同方式培养式培养l动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长l植物细胞和动物细胞植物细胞和动物细胞对剪切力敏感对剪切力敏感l植物、微生物和动物细胞的主要植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相目的产物各不相同同 动物细胞动物细胞 蛋白疫苗、抗体、激素、酶（蛋白质蛋白疫苗、抗体、激素、酶（蛋白质或多肽）或多肽） 植物细胞植物细胞 色素、香精、天然产物（小分子）、

4、色素、香精、天然产物（小分子）、酶酶l本章主要内容本章主要内容动植物细胞中酶生物合成的调节动植物细胞中酶生物合成的调节植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶l植物细胞及其培养特点植物细胞及其培养特点l植物细胞培养及产酶的工艺控制植物细胞培养及产酶的工艺控制动物细胞培养产酶动物细胞培养产酶l动物细胞及其培养特点动物细胞及其培养特点l动物细胞培养及产酶的工艺控制动物细胞培养及产酶的工艺控制l动植物细胞中酶生物合成的调节动植物细胞中酶生物合成的调节从基因到蛋白质从基因到蛋白质有关微生物细胞中酶合成的调节理论也基本适用于动植物细有关微生物细胞中酶合成的调节理论也基本适用于动植物细胞胞动植物细胞具有比微生物更

5、多的调节方式动植物细胞具有比微生物更多的调节方式l转录水平调节转录水平调节l翻译水平调节翻译水平调节l激素、神经调节激素、神经调节目前为止，还没有完整的理论和模型来阐述动植物细胞中酶生物合目前为止，还没有完整的理论和模型来阐述动植物细胞中酶生物合成的调节规律。成的调节规律。本节仅从细胞分化改变酶的生物合成、本节仅从细胞分化改变酶的生物合成、基因扩增基因扩增加速酶的生物合成、加速酶的生物合成、增强子增强子促进酶的生物合成、促进酶的生物合成、抗原诱导抗原诱导抗体酶的生物合成等几个方抗体酶的生物合成等几个方面介绍动植物细胞中酶生物合成的调节。面介绍动植物细胞中酶生物合成的调节。DNA RNA Pro

6、tein Active Enzyme转录逆转录复制翻译？折叠l动植物细胞中酶生物合成的调节动植物细胞中酶生物合成的调节1. 细胞分化改变酶的生物合成细胞分化改变酶的生物合成 端粒端粒l端粒端粒是真核生物染色体的末端结构是真核生物染色体的末端结构l由富含由富含 G、T 的的 DNA 简单重复序列不断重复而成简单重复序列不断重复而成 人端粒序列：人端粒序列：TTAGGGl保护真核生物染色体免遭破坏保护真核生物染色体免遭破坏 牺牲自我，填补牺牲自我，填补 DNA 复制后在复制后在5-端留下的空隙，保护了染色体端留下的空隙，保护了染色体结构和功能的完整性。结构和功能的完整性。 端粒随细胞年龄的增长而逐

7、渐缩短端粒随细胞年龄的增长而逐渐缩短l端粒酶端粒酶 催化端粒合成和延长催化端粒合成和延长 核糖核蛋白，其中的核糖核蛋白，其中的 RNA 部分含核苷酸模板序列，可构建端粒重部分含核苷酸模板序列，可构建端粒重复序列。复序列。 端粒酶一般存在于分化程度较低的细胞中。端粒酶一般存在于分化程度较低的细胞中。如单细胞四膜虫等前毛虫类的端粒很短，细胞内式中保持高活性的端如单细胞四膜虫等前毛虫类的端粒很短，细胞内式中保持高活性的端粒酶，酶活性受抑制将导致细胞寿命缩短；粒酶，酶活性受抑制将导致细胞寿命缩短；人的正常细胞内有很长的端粒，却没有检测到端粒酶的活性，但是分人的正常细胞内有很长的端粒，却没有检测到端粒酶

8、的活性，但是分化程度较低的癌细胞中可明显检测到端粒酶的活性。化程度较低的癌细胞中可明显检测到端粒酶的活性。l动植物细胞中酶生物合成的调节动植物细胞中酶生物合成的调节2. 基因扩增加速酶的合成基因扩增加速酶的合成l是指通过增加基因的数量来调节基因表达的一种是指通过增加基因的数量来调节基因表达的一种方式；方式；l可以发生在个体发育某一阶段或细胞分化某一过可以发生在个体发育某一阶段或细胞分化某一过程。程。l细胞的一种应急方式细胞的一种应急方式l基因扩增可以由选择压力引起基因扩增可以由选择压力引起 耐药性细胞的抗药性产生耐药性细胞的抗药性产生 例：田鼠细胞为对抗氨甲基喋呤对二氢叶酸还原酶的例：田鼠细胞

9、为对抗氨甲基喋呤对二氢叶酸还原酶的抑制，编码这种酶的基因急剧扩增，以更快的速度合抑制，编码这种酶的基因急剧扩增，以更快的速度合成大量的二氢叶酸还原酶。成大量的二氢叶酸还原酶。l动植物细胞中酶生物合成的调节动植物细胞中酶生物合成的调节3. 增强子促进酶的生物合成增强子促进酶的生物合成l增强子增强子 能高效增强或促进基因转录的一段能高效增强或促进基因转录的一段DNA 序列。序列。l特性：增强子能促进同源或异源启动基因的转录特性：增强子能促进同源或异源启动基因的转录活性，可高效增强某些酶基因的表达。活性，可高效增强某些酶基因的表达。l具有细胞或组织特异性，在不同细胞或组织中增具有细胞或组织特异性，在

10、不同细胞或组织中增强效果不同。强效果不同。l动植物细胞中酶生物合成的调节动植物细胞中酶生物合成的调节4. 抗原诱导抗体酶的生物合成抗原诱导抗体酶的生物合成l抗体酶：又称催化性抗体，是具有生物催化功能抗体酶：又称催化性抗体，是具有生物催化功能的抗体分子，是人工改造的对抗体可变区赋予催的抗体分子，是人工改造的对抗体可变区赋予催化特性的特殊抗体。化特性的特殊抗体。l抗体是由抗原诱导产生的能与抗原特异结合的免抗体是由抗原诱导产生的能与抗原特异结合的免疫球蛋白。疫球蛋白。l抗体酶的制备方法：抗体酶的制备方法：l修饰法修饰法对抗体进行分子修饰对抗体进行分子修饰在抗体与抗原结合部位引进催化基团在抗体与抗原结

11、合部位引进催化基团l诱导法（主要方法）诱导法（主要方法）利用特定的抗原诱导抗利用特定的抗原诱导抗体酶合成。体酶合成。 半抗原诱导半抗原诱导1.酶蛋白诱导酶蛋白诱导l第二节第二节 植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶l植物是各种色素、药物、香精和酶等天然产物的主要植物是各种色素、药物、香精和酶等天然产物的主要来源。来源。l天然化合物超过天然化合物超过3000中，其中中，其中80%以上来自植物；中以上来自植物；中草药及其制剂草药及其制剂80%以上来源于植物；全世界每年使用以上来源于植物；全世界每年使用的植物来源的芳香化合物的价值超过的植物来源的芳香化合物的价值超过15亿美元。亿美元。例如：木瓜中提取木

12、瓜蛋白酶和木瓜凝乳蛋白酶；人参例如：木瓜中提取木瓜蛋白酶和木瓜凝乳蛋白酶；人参中提取分离人参皂苷；紫草根中提取分离紫草宁；中提取分离人参皂苷；紫草根中提取分离紫草宁；玫玫瑰茄瑰茄中分离花青素；茉莉花中提取分离茉莉香精；中分离花青素；茉莉花中提取分离茉莉香精；鼠鼠尾草尾草中提取分离迷迭香酸等。中提取分离迷迭香酸等。人参皂苷具有较高的抗肿瘤人参皂苷具有较高的抗肿瘤活性，对正常细胞无毒副作活性，对正常细胞无毒副作用；可以通过调控肿瘤细胞用；可以通过调控肿瘤细胞增殖周期、诱导细胞分化和增殖周期、诱导细胞分化和凋亡来发挥抗肿瘤作用。凋亡来发挥抗肿瘤作用。l植物细胞培养产酶的提出：1902年，Haberl

13、andt首次提出分离植物单细胞并培养成植株的设想。植物细胞的全能性产酶植物细胞产酶品种胡萝卜细胞糖苷酶紫苜蓿细胞-半乳糖苷酶甜菜细胞过氧化物酶、酸性/碱性转化酶、糖化酶大豆细胞过氧化物酶、苯丙氨酸裂合酶花生细胞苯丙氨酸裂合酶假挪威槭细胞漆酶利马豆细胞-葡萄糖苷酶番木瓜细胞木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶大蒜细胞超氧化物歧化酶菠萝细胞菠萝蛋白酶剑麻细胞剑麻蛋白酶l植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶种类植物细胞培养产酶种类l植物细胞培养产酶植物细胞结构l一、植物细胞的特性一、植物细胞的特性植物细胞的主要特点植物细胞的主要特点l体积较大：比动物细胞和微生物细胞都大体积较大：比动物细胞和微生物

14、细胞都大l细胞生长速率和代谢速率低于微生物细胞，生细胞生长速率和代谢速率低于微生物细胞，生长周期长长周期长l营养要求较动物细胞简单营养要求较动物细胞简单l细胞生长及合成次级代谢产物需要光照条件细胞生长及合成次级代谢产物需要光照条件（反应器设计和实际操作）（反应器设计和实际操作）l对剪切力较敏感（通风、搅拌方面）对剪切力较敏感（通风、搅拌方面）主要用于产天然产物、色素、药物、香精等有主要用于产天然产物、色素、药物、香精等有机物（次级代谢物）机物（次级代谢物）l二、植物细胞培养的特点二、植物细胞培养的特点植物细胞培养的优势植物细胞培养的优势l提高目标物的产率（例如提高目标物的产率（例如p70）l缩

15、短生产周期（倍增时间缩短生产周期（倍增时间12-60h；生产周期一；生产周期一般般15-30d）木瓜蛋白酶：木瓜生长期木瓜蛋白酶：木瓜生长期8个月，木瓜细胞培养约个月，木瓜细胞培养约1个月个月l易于管理，不受自然因素控制。易于管理，不受自然因素控制。l可以提高产物质量可以提高产物质量通过严格的培养条件控制，减少植株病虫害和污染通过严格的培养条件控制，减少植株病虫害和污染缺点缺点l培养条件要求高培养条件要求高 光照、剪切力影响显著光照、剪切力影响显著植物细胞生长缓慢植物细胞生长缓慢 相对于微生物相对于微生物三、植物细胞培养的工艺条件及其控制（一）植物细胞培养的工艺流程（一）植物细胞培养的工艺流程

16、l胚培养、器官培养、愈伤组织培养、细胞培养胚培养、器官培养、愈伤组织培养、细胞培养l植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶1. 外植体选择和处理外植体选择和处理l外植体（外植体（explant） 从植株取出，经预处理后用于组织和细胞培养的植物从植株取出，经预处理后用于组织和细胞培养的植物组织片段或小块。组织片段或小块。 根、茎、叶、芽、花、果实、种子等根、茎、叶、芽、花、果实、种子等l选择：无病虫害、生长旺盛、生长有规则选择：无病虫害、生长旺盛、生长有规则l切片：切片：1 cml消毒消毒 70% 乙醇乙醇 5% 次氯酸钠次氯酸钠 / 10% 漂白粉漂白粉 0.1% HgCl2l植物细胞培养产酶植物细

17、胞培养产酶2. 获取植物细胞获取植物细胞直接分离法、愈伤组织直接分离法、愈伤组织诱导法和原生质体再生法。诱导法和原生质体再生法。（1）直接分离法）直接分离法l直接分离法即直接从外植体中分离直接分离法即直接从外植体中分离l机械法机械法 将外植体捣碎，过滤或离心分离细胞；将外植体捣碎，过滤或离心分离细胞； 优点：植物细胞没有经过酶的作用，不会伤害细胞；优点：植物细胞没有经过酶的作用，不会伤害细胞；不经过质壁分离，有利于生理和生化研究。不经过质壁分离，有利于生理和生化研究。 缺点缺点: 细胞破碎率高，完整细胞数量少细胞破碎率高，完整细胞数量少.l酶解法酶解法 利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体，分离具

18、有代谢利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体，分离具有代谢活性的细胞。活性的细胞。 特点：能降解细胞壁，必须对细胞给予渗透压保护。特点：能降解细胞壁，必须对细胞给予渗透压保护。如添加甘露醇。如添加甘露醇。获取植物细胞方法：获取植物细胞方法：（2）愈伤组织诱导法）愈伤组织诱导法l愈伤组织愈伤组织 由外植体组织增生的细胞产生的团状不定型的疏散排由外植体组织增生的细胞产生的团状不定型的疏散排列的薄壁细胞群体；本意是指植物体的局部受到创伤列的薄壁细胞群体；本意是指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的可帮助伤口愈合的组织刺激后，在伤口表面新生的可帮助伤口愈合的组织l诱导过程诱导过程 配制半固体诱导培养

19、基配制半固体诱导培养基（生长素（生长素+分裂素分裂素+0.7%琼脂）琼脂） 灭菌、植入外植体灭菌、植入外植体 13周后继代分散培养周后继代分散培养l获取植物细胞方法：获取植物细胞方法：l（3）原生质体再生法）原生质体再生法l一般采用酶解法分离原生质体，使用纤维素酶和一般采用酶解法分离原生质体，使用纤维素酶和果胶酶混合物果胶酶混合物l保持溶液的高渗状态保持溶液的高渗状态 防止原生质体胀裂防止原生质体胀裂 渗透压稳定剂：糖类、盐类、甘露醇、山梨醇等渗透压稳定剂：糖类、盐类、甘露醇、山梨醇等l原生质体分离后进行原生质体培养，在一定条件原生质体分离后进行原生质体培养，在一定条件下再生出细胞壁，形成单细

20、胞悬浮液。下再生出细胞壁，形成单细胞悬浮液。l植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶l3、细胞悬浮培养、细胞悬浮培养l将游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬将游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬浮在液体培养基中进行培养的方法。浮在液体培养基中进行培养的方法。l悬浮培养的细胞一般来源于愈伤组织，选择较松悬浮培养的细胞一般来源于愈伤组织，选择较松散的为宜。散的为宜。4、产物分离纯化、产物分离纯化l收集培养液，从中获得所需的产物。收集培养液，从中获得所需的产物。l（二）植物细胞培养的培养基（二）植物细胞培养的培养基植物细胞培养基植物细胞培养基l水：一般用去离子水或蒸馏水水：一般用去离子水或蒸馏水l

21、无机成分无机成分 大量元素：大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S（102-3*103mg/L） 微量元素：微量元素：Fe、B、Mn、Zn、Cu、Mo、Co(10-230mg/L)l有机成分有机成分 碳源：糖，以蔗糖最常用碳源：糖，以蔗糖最常用 氮源：无机氮，可同化硝酸盐和铵盐。氮源：无机氮，可同化硝酸盐和铵盐。 维生素：主要是维生素：主要是B族维生素和维生素族维生素和维生素C 生长调节剂：生长激素、细胞分裂素等（微量）生长调节剂：生长激素、细胞分裂素等（微量） 其他：肌醇、琼脂等其他：肌醇、琼脂等l植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶常用的植物细胞培养基常用的植物细胞培养基lMS 培养基培养基培养

22、烟草细胞培养烟草细胞 硝酸盐浓度较高，营养成分适宜，使用范围广硝酸盐浓度较高，营养成分适宜，使用范围广lB5 培养基培养基培养大豆细胞培养大豆细胞 NH4+ 浓度较低，适用于双子叶木本植物浓度较低，适用于双子叶木本植物lWhite 培养基培养基培养番茄根尖培养番茄根尖 无机盐浓度低，高无机盐浓度低，高Mg(II)、B(III)，适用于生根培养，适用于生根培养lKM-8P 培养基培养基 有机成分种类齐全，用于原生质体培养有机成分种类齐全，用于原生质体培养培养基配制培养基配制l配制母液，使用时按需要稀释。配制母液，使用时按需要稀释。l植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶工艺条件及其控制工艺条件及其控制

23、l温度温度 室温范围室温范围25 oC左右（温度高些对细胞生长有利左右（温度高些对细胞生长有利（20）。）。） 最适产酶温度和最适生长温度不同最适产酶温度和最适生长温度不同lpH 微酸性（微酸性（pH 56） 细胞培养时，细胞培养时，pH一般变化不大一般变化不大l溶解氧溶解氧 植物细胞需氧量不高，供氧不宜过量。植物细胞需氧量不高，供氧不宜过量。 对剪切力敏感，通风搅拌不宜太剧烈，以免破坏细胞。对剪切力敏感，通风搅拌不宜太剧烈，以免破坏细胞。l植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶工艺条件及其控制工艺条件及其控制l光照光照 光照对植物细胞的生长和产物合成具有重要影响（植光照对植物细胞的生长和产物合成具

24、有重要影响（植物特色）物特色） 光照有时也抑制产物合成（例如光照有时也抑制产物合成（例如p76）l添加前体添加前体 前体：处于目的代谢物代谢途径上游的物质前体：处于目的代谢物代谢途径上游的物质 添加前体相对于添加了反应的底物（例如添加前体相对于添加了反应的底物（例如p76辣椒胺辣椒胺生产）生产）l刺激剂（刺激剂（elector） 引导物质朝特定的代谢方向进行，强化次级代谢产物引导物质朝特定的代谢方向进行，强化次级代谢产物的生物合成的生物合成 常用微生物细胞壁碎片和胞外酶（例如常用微生物细胞壁碎片和胞外酶（例如p76）l植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶产酶实例产酶实例 大蒜细胞培养产大蒜细胞培养

25、产 SODl超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（SOD，），） 超氧化歧化酶：是生物体内清除超氧化物阴离子自由超氧化歧化酶：是生物体内清除超氧化物阴离子自由基（基（O2-）的重要金属酶类，可以催化超氧负离子进）的重要金属酶类，可以催化超氧负离子进行氧化还原反应的氧化还原酶，具有抗辐射、抗氧化、行氧化还原反应的氧化还原酶，具有抗辐射、抗氧化、抗衰老的功效。抗衰老的功效。 来源：动物、植物和微生物细胞中提取分离。来源：动物、植物和微生物细胞中提取分离。 SOD 和过氧化氢酶和过氧化氢酶 (catalase)、过氧化物酶、过氧化物酶 (peroxidase，POD) 一起构成了生物体内重要的酶促一起构成

26、了生物体内重要的酶促反应防御体系，从而维护生物体内细胞正常的生理代反应防御体系，从而维护生物体内细胞正常的生理代谢和生化反应。谢和生化反应。l植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶产酶实例产酶实例 大蒜细胞培养产大蒜细胞培养产 SODl大蒜愈伤组织的诱导大蒜愈伤组织的诱导 选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，在选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，在4冰箱冰箱中放置中放置3周，打破休眠；去除外皮。周，打破休眠；去除外皮。 先用先用70% 乙醇消毒乙醇消毒 20 s，再用，再用0.1%升汞消毒升汞消毒 10 min，然后无菌水漂洗然后无菌水漂洗3次次 在无菌条件下，切成在无菌条件下，切成0.5 cm3

27、的小块，植入含有的小块，植入含有3 mg/L 2,4-D和和1.2 mg/L 6-BA 的半固体的半固体MS 培养基中，培养基中，25 oC，600 lux，12 h/d光照条件下培养光照条件下培养18天，诱导得到愈伤天，诱导得到愈伤组织，每组织，每18天传代一次。天传代一次。l植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶产酶实例产酶实例 大蒜细胞培养产大蒜细胞培养产 SODl大蒜细胞悬浮培养大蒜细胞悬浮培养 将上述在半固体将上述在半固体 MS 培养基上培养培养基上培养18天的愈伤组织，天的愈伤组织，在无菌条件下转入含有在无菌条件下转入含有3 mg/L 2,4-D 和和 1.2 mg/L 6-BA 的液体

28、的液体 MS 培养基中，加入灭菌的玻璃珠，培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25 oC，600 lux，12 h/d光照条件下振荡培养光照条件下振荡培养1012天，使愈天，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞伤组织分散成为小细胞团或单细胞 无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3 mg/L 2,4-D和和1.2 mg/L 6-BA 的液体的液体 MS 培养基中，培养基中，25 oC，600 lux，12 h/d光照条件下振荡培养光照条件下振荡培养18天天lSOD 分离纯化分离纯化 收集细胞，破碎，用收集细胞，破碎，用pH 7.8 磷酸盐缓冲液提取、

29、有机磷酸盐缓冲液提取、有机溶剂沉淀等，分离得到超氧化物歧化酶。溶剂沉淀等，分离得到超氧化物歧化酶。l第三节第三节 动物细胞培养产酶动物细胞培养产酶1907年，年，Harrison 开创了动物组织培养的先开创了动物组织培养的先河河l从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，放在青蛙的凝从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，放在青蛙的凝固的淋巴液中培养，蝌蚪的神经组织存活了数周，固的淋巴液中培养，蝌蚪的神经组织存活了数周，并且从神经细胞中长出了神经纤维并且从神经细胞中长出了神经纤维1950s，Earle 用动物细胞培养制取病毒疫苗用动物细胞培养制取病毒疫苗1967年，动物细胞贴壁培养微载体开发年，动物细胞贴壁培养微载

30、体开发1975年，杂交瘤技术年，杂交瘤技术动物细胞可产生较高价值的物质动物细胞可产生较高价值的物质l激素、疫苗、单克隆抗体、酶激素、疫苗、单克隆抗体、酶l动物细胞培养产酶动物细胞结构l动物细胞培养产酶动物细胞培养产酶一、动物细胞特性一、动物细胞特性l 没有细胞壁，细胞脆弱（区别于植物和微生物）。没有细胞壁，细胞脆弱（区别于植物和微生物）。l 体积比微生物细胞大几千倍，但稍小于植物细胞。体积比微生物细胞大几千倍，但稍小于植物细胞。l 在肌体内相互粘连，以群体形式存在。在培养时在肌体内相互粘连，以群体形式存在。在培养时具有群体效应、贴壁依赖性、接触抑制性、功能具有群体效应、贴壁依赖性、接触抑制性、

31、功能全能性全能性营养要求复杂，必须提供给各种氨基酸、维生营养要求复杂，必须提供给各种氨基酸、维生素、激素和生长因子等（血清培养基）。素、激素和生长因子等（血清培养基）。l动物细胞培养产酶动物细胞培养产酶二、动物细胞培养的特点二、动物细胞培养的特点l 主要用于生产功能蛋白质（主要用于生产功能蛋白质（P77）如：疫苗、激）如：疫苗、激素、多肽生长因子（神经生长因子）、酶（胶原素、多肽生长因子（神经生长因子）、酶（胶原酶、纤溶酶原活化剂、尿激酶）、单克隆抗体、酶、纤溶酶原活化剂、尿激酶）、单克隆抗体、非抗体免疫调节剂（干扰素、白细胞介素、集落非抗体免疫调节剂（干扰素、白细胞介素、集落刺激因子等。）刺

32、激因子等。）l 生长缓慢生长缓慢l 容易受污染（细菌、支原体），培养过程中需添容易受污染（细菌、支原体），培养过程中需添加抗生素。加抗生素。l 对剪切力特别敏感（胞外缺少保护结构）对剪切力特别敏感（胞外缺少保护结构）l 大部分具有锚地依赖性大部分具有锚地依赖性 贴壁培养贴壁培养l 培养基成分复杂，价格高昂，适用于高价值药物培养基成分复杂，价格高昂，适用于高价值药物的生产。的生产。细胞生命有限，一般最多继代培养细胞生命有限，一般最多继代培养50代即退化代即退化死亡。死亡。l三、动物细胞培养方式三、动物细胞培养方式l1、悬浮培养、悬浮培养l适用于非贴壁依赖型细胞适用于非贴壁依赖型细胞 杂交瘤细胞、

33、肿瘤细胞、体液（血液、淋巴液）细胞杂交瘤细胞、肿瘤细胞、体液（血液、淋巴液）细胞l类似于微生物细胞的深层发酵，但工艺条件有较类似于微生物细胞的深层发酵，但工艺条件有较大差别大差别 对通气、搅拌耐受性差。对通气、搅拌耐受性差。 对氧气的要求较微生物低，培养时需通入一定比例对氧气的要求较微生物低，培养时需通入一定比例 CO2l优点（相对于贴壁培养）优点（相对于贴壁培养） 细胞在培养液中均匀分散，生长情况良好细胞在培养液中均匀分散，生长情况良好 传代培养容易，无需消化分散细胞传代培养容易，无需消化分散细胞 培养基中营养成分利用率高培养基中营养成分利用率高三、动物细胞培养方式三、动物细胞培养方式 2.

34、 贴壁培养贴壁培养l适用于贴壁依赖型细胞适用于贴壁依赖型细胞 上皮细胞、成纤维细胞上皮细胞、成纤维细胞 细胞在培养容器表面迅速铺展并分裂细胞在培养容器表面迅速铺展并分裂l滚瓶培养系统滚瓶培养系统 结构简单，但比表面积小，体积产率较低。结构简单，但比表面积小，体积产率较低。l微载体培养系统微载体培养系统 由葡聚糖凝胶等聚合物制得的微球，通过连续搅拌可由葡聚糖凝胶等聚合物制得的微球，通过连续搅拌可以悬浮于培养液中。以悬浮于培养液中。 兼具单层培养和悬浮培养的优势。兼具单层培养和悬浮培养的优势。 细胞生长环境均一细胞生长环境均一l三、动物细胞培养方式三、动物细胞培养方式 l3、固定化培养、固定化培养

35、l贴壁或非贴壁依赖型细胞均适用贴壁或非贴壁依赖型细胞均适用l吸附法吸附法 载体为多孔性颗粒，如陶瓷颗粒、玻璃珠及硅胶颗粒载体为多孔性颗粒，如陶瓷颗粒、玻璃珠及硅胶颗粒 贴壁型细胞的微载体培养即属此类贴壁型细胞的微载体培养即属此类l包埋法包埋法 将细胞包埋于琼脂、琼脂糖、胶原及血纤维等海绵状将细胞包埋于琼脂、琼脂糖、胶原及血纤维等海绵状基质中基质中 细胞不易脱落细胞不易脱落l固定化培养优点固定化培养优点 细胞损伤程度低，可重复使用细胞损伤程度低，可重复使用 产物分离容易产物分离容易l动物细胞培养产酶动物细胞培养产酶四、动物细胞培养的工艺条件及其控制四、动物细胞培养的工艺条件及其控制l种质细胞种质细胞 体细胞（动物体内组织取出）体细胞（动物体内组织取出） 杂交瘤细胞杂交瘤细胞l基本工艺过程基本工艺过程l动物细胞培养产酶动物细胞培养产酶动物细胞培养基动物细胞培养基l 氨基酸：各种必需氨基酸，氨基酸：各种必需氨基酸，Gln 等，作为碳源和等，作为碳源和能源利用能源利用l 维生素：维生素：B族和维族和维C，可由血清提供，可由血清提供l 无机盐：调节渗透压无机盐：调节渗透压l 微量元素：微量元素：Fe、Cu、Zn等，可由血清提供等，可由血清提供l 葡萄糖：作为碳源和能源（易产生乳酸）葡萄糖：作为碳源和能源（易产生乳酸）l 激素：胰岛素、生长激素