免疫增强剂提高禽流感疫苗效力的研究.docx

1、唐应华，陆吉虎,吴培培，等.免疫增强剂提高禽流感疫苗效力的研究J.江苏农业学报,2014,30(2):3440348.doi:10.3969/j.issn.1000S4440.2014.02.019免疫增强剂提高禽流感疫苗效力的研究唐应华，陆吉虎，吴培培，刘振兴，田震，查国飞，陈辉，侯继波(江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，江苏南京210014)摘要：为评价免疫增强剂(VA5)对鸡的免疫效力，将不同剂量免疫增强剂与H9禽流感抗原混合后制备疫苗，评价对SPF鸡的免疫效力。根据筛选结果，将最适剂量的免疫增强剂与H9禽流感抗原以共同混合的形式配制

2、疫苗，并将免疫增强剂以伴侣形式与H5或H9禽流感疫苗混匀免疫商品鸡，评价免疫增强效果。结果表明，免疫增强剂与H9疫苗共同混匀，或将免疫增强剂制备成疫苗伴侣形式与H5或H9商品疫苗共同混合免疫商品鸡，均能使H5或H9疫苗免疫后抗体提前1周达到71g2,免疫后23周抗体效价显著高于不含免疫增强剂的常规疫苗组。该免疫增强剂能提高H5和H9亚型禽流感疫苗对鸡的免疫效力，具有较好的应用前景。关键词：免疫增强剂；115亚型禽流感疫苗；H9亚型禽流感疫苗；疫苗伴侣中图分类号：S852.65+9.5文献标识码:A文章编号：1000邺4440(2014)02郸0344甄)5Evaluationofimmunop

3、otentiatorsforimprovingtheefficacyofavianinjfluenzavaccineTANGYinghua,LUJi*hu,WUPeifeei,LIUZhenjxing,TIANZhen,ZHAGuo*fei,CHENHui,HOUJi郸bo(NationalResearchCenterofEngineeringandTechnologyforVeterinaryBiologicalsKeyLaboratoryofEngineeringandTechnologyforVeterinaryBiologi?cals,MinistryofAgriculture,Jia

4、ngsuAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing210014,China)Abstract:Toevaluatetheefficacyofacompoundimmunopotentiators(VA5)inchicken,theH9avianinfluenzavaccinescontainingdifferentdosesofimmunopotentiatorswerepreparedinwhichtheimmunopotentiatorweremixedwithvi|ralantigenduringthevaccinedevelopmentprocess.T

5、heoptimaldoseofimmunopotentiatorswasdeterminedbyevaluationoftheefficacyofimmunopotentiatorscontaininginfluenzavaccineinspecificpathogenfree(SPF)chicken.Theefficacyoftwoforms,eitherusedasadditioninvaccineantigenoraschaperonwithcommercialvaccine,ofoptimaldoseofimmunopoStentiatorswerethenevaluatedincom

6、mercialchicken.Inadditionform,immunopotentiatorwasmixedwith119avianinfluxenzaviralantigentopreparevaccine.Inchaperonform,itwaspreparedaswaterinoilemulsionandmixedwithH9or115subtypoavianinfluenzavaccine.ResultsofSPFchickentest收稿日期:2013S06®03基金项目：国家自然科学基金项目(31201904);科技部国家高技术研究发展计划“863冶课题(2011AA1

7、0A213);农业部公益性行业(农业)科研专项经费项目(201303046);江苏省农业自主创新项目CX(12)3077作者简介：唐应华(1981S),男，湖南东安人，博士，副研究员，主要从事禽病毒性疾病致病机理和防控研究，(Elmail)tyinghuayahoo,com通讯作者：侯继波，(Tel)865025584392008;(E&nail)houjibojaas.showedthattheeffectivenessoftheminimumdoseofimmuno%potentiatorswassuperiortothatofotherdoses.Theantibodytiter

8、sreachedto71g2oneweekinadvancethanthatofchickensvaccinatedwithimmunopotentiatorcontaijningH5or119subtypevaccinewhencomparedtothatchickensvaccinatedwiththeconventionalinactivatedH5orH9subtypeinfluenzavaccine,andregardlessoftheim5munipotentiatorusedasadditionformorchaperonform.Furthermore,or3，weekpost

9、vaccination,theantibodytitersingroupofchickensvaccinatedwithimmunopotentijatorcontainingvaccineweresignificantlyhigherthanthatofconventionalvaccinegroup.Theimmunopotentiatorcanimprovetheefficacyon115and119avianinfluenzavaccineinchicken,andshowsprospectinclinicalapplication.Keywords:immunopotentiator

10、s;H5subtypeavianinfluenzavaccine;H9subtypeavianinfluenzavaccine;chaperoneH5亚型和H9亚型禽流感严重威胁中国养鸡业的发展。禽流感灭活疫苗对中国禽流感的防控发挥了重要作用。由于流感病毒自身易于变异使得现有的疫苗难以对新出现的变异株提供有效保护2要不断筛选和更新与流行毒株抗原性一致的疫苗毒株,而筛选新疫苗毒株至新毒株疫苗用于临床，存在一段窗口期。临床生产亟需通过更换毒株之外的其他方法提高现有疫苗的保护效力.使用免疫增强剂是提高现有疫苗保护效力的有效途径之一。人用疫苗中，已经有部分免疫增强剂获得商品化,包括人流感疫苗佐剂MF5

11、9、疟疾疫苗佐剂AS02、单纯包疹疫苗和人乳头瘤病毒疫苗佐剂AS04。兽用疫苗中，如猪支原体疫苗佐剂Am邺phigen等。各种天然免疫受体及其激动剂在机体的免疫应寸齿早中发重要作用6。这些激动剂自身亦是良好的免疫增强剂，如CpG.Polyl:C、脂多糖（lip福lysaccharide,IPS）、咪唆莫特、雷西莫特、脂肽（li郭popeptides）、鞭毛蛋白和胞岷酰二肢等7驾9,一些化学药物和中草药多融成分也具有良好的免疫增强作用，如左旋咪哇、黄芷多鞘、香菇多糖、菊粉等101本实验室从多种具有免疫增强效果的成分中，筛选获得一些有良好免疫增强作用的复方免疫增强剂。本研究将其中一种免疫增强剂（V

12、A5）对禽流感疫苗的免疫增强效果进行评价。1材料和方法1病毒、疫苗和检测抗原H9亚型禽流感病毒AlChickenINanjing/02/2001（简称NJ02）和A/ChickenIShandong/01/2011（简称SD01）均由本室鉴定、保存。对2株病毒的序列进行测定，与GenBank中公布的中国近期H9病毒流行株，用MEGA4.1进行比对，绘制遗传进化树。H5（Re邺5）亚型禽流感商品疫苗和Re邺5检测抗原均购自哈尔滨维科生物技术开发公司。1. 2含免疫增强剂疫苗的配制含VA5免疫增强剂疫苗的配制详见专利（申请号201210235427.0）。简要描述其2种不同形式配制过程如下：淤与抗

13、原共同混合形式（简称“共混幻。在磷酸盐缓冲液（PBS）中加入Polyl:C胞壁酰二肽和左旋咪哇，然后加入吐温卵80,配制成水相溶液;在水相溶液中加入灭活疫苗抗原,混匀后得到灭活抗原溶液；在白油中加入雷西莫特、咪喳莫特，然后加入司盘升80配制成油相溶液；将灭活抗原溶液与油相溶液混合制备疫苗。于疫苗伴侣形式（简称“伴侣冶）。在磷酸盐缓冲液（PBS）中加入Polyl:C、胞壁酰二肽和左旋咪哇，然后加入吐温-80,配制成水相溶液；在白油中加入雷西莫特、咪哇莫特，然后加入司盘郸80配制成油相溶液；将含免疫增强剂的水相溶液与油相混合，制备成油乳剂的疫苗伴侣。将该疫苗伴侣与事先制备的常规灭活疫苗或商品灭活疫

14、苗按体积比为1颐9混合，即为含VA5免疫增强剂的伴侣疫苗。含VA5免疫增强剂的H9疫苗，以共混形式配制。参照疫苗规程，疫苗毒为NJ02株，每羽份疫苗含抗原量为10&°鸡胚半数感染量（Medianembryoinfectiousdose,EID5o）,VA5高、中、低剂量参考专利（申请号:201210235427.0）,疫苗简称为H9JVA55H、H9KVA5KM和H9®VA5®Lo不含免疫增强剂的常规H9疫苗，简称H9o含VA5免疫增强剂的H5疫苗，以伴侣形式配制。即将H5商品疫苗根据含VA5高中低3种剂量,简称为H5郸VA5M5H、H5KVA5SM和H5

15、邺VA5耻不含免疫增强剂的H5商品疫苗,简称为H5o3SPF鸡SPF鸡购自北京梅里亚维通实验动物有限公司，饲养在负压隔离器内，直至使用。1日龄商品海兰褐鸡购自海安某种鸡场，在普通环境饲养至使用。1. 4不同剂量免疫增强剂在SPF鸡的免疫效果测定选择高、中、低不同剂量的VA5免疫增强剂H9共混疫苗免疫10日龄SPF鸡，每只鸡013ml,每组10只鸡，共3组，即H9卵VA5甄I组、H90VA5W组和II9SVA50L组.另设常规H9疫苗组和空白对照组，每组10只鸡。免疫后第1周第2周第3周采血，留作抗体检测:第3周采血结束后，用011ml含1世10"EID50H9亚型病毒SD01毒经滴鼻

16、途径攻毒。攻毒后第1、3、5和7d采取喉气管和泄殖腔棉拭，用于病毒分离。将每只鸡每次采得的喉气管和泄殖腔棉拭合并后接种鸡胚。每分混合拭子接种3个鸡胚，每胚0!ImL去除24h内死亡的鸡胚，观察各组鸡胚的死亡情况，在120h后将所有健活鸡胚置4益冻死，检测各胚的HA效价。以3个胚中的1个或以上出现HA效价高于41g2记为阳性。1.5商品海兰褐鸡免疫含VA5免疫增强剂的H9疫苗商品海兰褐鸡免疫前采血检测血凝抑制抗体(Hemagglutinininhibition,HI)母源抗体,以HI母源抗体效价低于21g2时免疫。将VA5免疫增强剂(VA5KL剂量)以伴侣形式与H9疫苗混合后，免疫14日龄商品鸡

17、，另设常规疫苗对照和不免疫的空白对照,每只鸡013ml,每组20只鸡，免疫后第2周、第3周和第4周采血，留作抗体检测。参照SPF鸡的免疫，将VA5SL剂量与H9抗原共混合后，制备疫苗。免疫14日龄商品鸡，另设常规疫苗对照和不免疫的空白对照，每只鸡0S3ml,每组20只鸡。免疫后第2周、第3周和第4周采血,留作抗体检测。1.6商品海兰褐鸡免疫含VA5®L伴侣的H5疫苗商品海兰褐鸡免疫前采血检测血凝抑制抗体(Hemagglutinininhibition,HI)母源抗体，以HI母源抗体效价低于21g2时免疫。以低剂量的VA5免疫增强剂以伴侣形式与H5疫苗混合后，免疫14日龄商品鸡，另设常

18、规疫苗对照和不免疫的空白对照，每只鸡013ml,每组20只鸡。免疫后第2周、第3周和第4周采血，留作抗体检测。1. 7抗体检测采用微量血凝抑制法(HI)检测抗体。2结果1病毒遗传进化比较对疫苗毒株NJ02和攻毒毒株SD01的HA基因测序后，将二者的开放阅读框(Openreadingframe,ORF)序列与GenBank下载的序列用MEGA4.0进行比对(NeighborWjoining,1000bootstrapreplicates)。NJ02与中国早期(19942001年)分离株在同一进化分支，而SD01与近期(20072011年)分离株在同一分支(图1)。上述结果提示，疫苗用毒株与攻毒毒

19、株在基因水平上具有一定差异，适于作为攻毒毒株。翌.金幽峰濒i殴切嗽廖麒芸阳II电|一Ar瀚血"澜辨O舞O1炉对够方1图1H9病毒遗传进化分析比较Fig.1PhylogeneticanalysisofH9virusesBo2含VA5免疫增强剂的H9混合疫苗对SPF鸡的免疫效力SPF鸡免疫后第1周、第2周和第3周采血，分离血清，检测HI抗体效价。含免疫增强剂的3个组在免疫后第2周，抗体效价即高于71g2,而常规疫苗在免疫后第3周抗体效价超过71g2o含免疫增强剂的疫苗组在免疫后第3周和第4周的血清效价与常规疫苗免疫组相比，均差异极显著（P<0鄙01）（图2）o在免疫后攻毒，检测喉气

20、管和泄殖腔的棉拭样品。含免疫增强剂的疫苗组在免疫后均未检测到病毒。而常规疫苗组在免疫后第5d尚有1/10病毒分离阳性，空白对照组在第7d尚能分离到病毒（4/口免痘后1岛色蟀2嘉竟蟀3嘉免痍后瞒H9SVA5BH:含高剂量VA5免疫增强剂的H9混合疫苗组;H9gVA5SM：含中等剂量VA5免疫增强剂的H9混合疫苗组;H9BVA5SL:含低剂量VA5免疫增强剂的H9混合疫苗组；119:常规H9疫苗组；对照组：未免疫的空白对照组。虚线表示达到合格时的抗体效价（71g2）o图2含VA5免疫增强剂的H9混合疫苗对SPF鸡的免疫效力Fig.2Efficacyof119antigenmixingwithVA5

21、immunpotentiajtorvaccineinSPFchicken表1SPF鸡免疫后H9病毒攻毒及排毒检测结果Table1H9subtypeviruschallengeandviralisolationofSPFchickenspostvaccination疫苗攻毒后病毒分离率（阳性数/总数）1d3d5d7dH9鄱VA5聊0/100/100/100/10H9JEVA5SM0/100/100/100/10H9SVA5SL0/100/100/100/10H93/101/101/100/10对照8/108/105/104/10H9SVA50H:含高剂量VA5免疫增强剂的H9混合疫苗;II9gV

22、A5SM:含中等剂量VA5免疫增强剂的H9混合疫苗;H9gVA5®L:含低剂量VA5免疫增强剂的H9混合疫苗;H9:常规H9疫苗；对照：未免疫的空白。2. 3含免疫增强剂的H9疫苗对商品鸡的免疫效力VA5免疫增强剂与H9抗原混合（H9WA5im）后制备疫苗，免疫商品鸡，或VA5免疫增强剂以疫苗伴侣形式（H9SSVA5郸c）与疫苗混合后免疫商品鸡,均在免疫后第2周抗体超过71g2o常规疫苗需在免疫后第3周才超过71g2o含免疫增强剂疫苗免疫组的第3周和第4周抗体效价与常规疫苗相比，均差异极显著（P<0鄙01）（图3）。口翱芟启2凌；栽疚后3周：鲍痍后痍H9SVA5gL（in）:含

23、低剂量VA5免疫增强剂的H9混合疫苗组；H9SJVA5郸L（c）:含低剂量VA5免疫增强剂的H9伴侣疫苗组；H9:常规H9疫苗组;对照组：未免疫的空白对照组。虚线表示达到合格时的抗体效价（71g2）。图3含VA5免疫增强剂H9疫苗对商品鸡鸡免疫效力Fig.3Efficacyof119vaccinecontainingVA5immunopotentiaStorincommercialchicken1. 4含VA5免疫增强剂的H5疫苗对商品鸡的免疫效力VA5免疫增强剂以疫苗伴侣形式（H9邺VA5邺c）与H5疫苗混合后免疫商品鸡，在免疫后第2周抗体超过71g20常规疫苗在免疫后第3周才超过71g2o

24、含免疫增强剂疫苗免疫组的第3周和第4周抗体效价与常规疫苗相比，均差异极显著（P<0®01）（图4）。3讨论含VA5免疫增强剂的H9疫苗,无论是与抗原混合后制成疫苗使用，或单独将该增强剂制成疫苗伴侣形式与疫苗共免疫，其免疫效果均优于常规疫苗,表现在抗体合格提前1周达标（71g2）,后续第3、4周抗体效价均显著高于常规疫苗（P<0|01）。将VA5免疫增强剂以伴侣形式与H5疫苗共免疫，其免疫效力类似于在H9疫苗中的应用效果。该免疫增强剂含有天然免疫受体中TollKlikere®口免痕后2周；兔疫总3嘉竟疫后演H5SVA59L:含低剂量VA5免疫增强剂的H5伴侣疫苗组

25、;H5:常规H5疫苗组；对照组：未免疫的空白对照组。虚线表示达到合格时的抗体效价(71g2)0图4含VA5免疫增强剂H5伴侣疫苗对商品鸡的免疫效力Fig.4Efficacyof115vaccinecontainingVA5immunpotentiaStorchaperoneincommercialchickenceptor(TLR)激动剂的成分。根据对TLR的研究结果，不同TLR在不同免疫类型的细胞上的丰度以及在细胞表面的位置均有差异"且不同信号通路最终所激活的免疫刺激因子略有差异11,但均能有效提高机体的细胞免疫12。因此木研究中我们选择多种受体激动剂的混合，以获得不同单组分协同效

26、应的笈合免疫增强剂。我们正在开展的后续研究包括:VA5免疫增强剂的安全性、保存期、免疫效力持续期和对不同联苗的使用等，以及该免疫增强剂在提高灭活疫苗免疫效力的免疫机理等。参考文献：ActinobacilluspleuropncumoniaeJ.CanJVetRes,2004,68(1) :66?70.6 AKIRAS,TAKEDAK,KAISHOT.Tolljlikereceptors:criticalproteinslinkinginnateandacquiredinnnuniiyJ.NatImniunol,2001,2(8):675蛤80.7 KAWAIT,AKIRAS.Theroleso

27、fTLRs,RLRsandNLRsinpathogenrecognitionJ.IntImmunol,2009,21(4):317J337.8 KRAUSD,KALBACIIERII,BUSCHMANNJ,etal.MuropepftidemodificationHamidalionofpeptidoglycanDgiulamatedoesnotaffecttheproinflammatoryactivityofStaphylococcusaureusJ.InfectImmun,2007,75(4):208412087.9 GANTNERBN,SIMMONSRM,CANAVERASJ,etal

28、.Col5laborativeinductionofinflammatoryresponsesbydectin*1andTollSlikereceptor2J.JExpMed,2003,197(9):110751117.10 GORDONDL,SAJKOVD,WOODMANRJ,etal.RandomizedclinicaltrialofimmunogenicityandsafetyofarecombinantH1N12009pandemicinfluenzavaccinecontainingAdvaxpolysaccharideadjuvantJ.Vaccine,2012,30(36):540715416.11 IWASAKIA,MEDZHITOVR.Regulationofadaptiveimmunitybyth