7例水痘患者水痘带状疱疹病毒的分离与鉴定分析.docx

1、.论著.7例水痘患者水痘带状疱疹病毒的分离与鉴定分析张夫坤李三景2，赫宝双I,戴龙I,卢佳3,王香娜2,唐静2,郁春要2,霍玉奇2,沈红杰I1.长春祈健生物制品有限公司研究室，吉林长春130000；2.郑州市第六人民医院感染三科，河南郑州450000；3.武汉生物制品研究所有限责任公司疫苗研究一室，湖北武汉430000摘要：目的对7例临床水痘患者的疱疹液样本，进行水痘带状疱疹病毒(varicella-herpeszostervirus,VZV)的分离及鉴定分析。方法对7例临床水痘患者的疱疹液，用2BS细胞进行病毒分离及病毒滴度检测;用特异性引物分别对病毒分离株及疫苗株(Oka株)的ORF68、

2、ORF54、ORF38进行聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)扩增及测序，用DNAMAN软件对病毒分离株的ORF68序列与Dumas株序列进行比对鉴定，并对病毒分离株和Oka株的0RF54、ORF38进行限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)分析。结果从7例临床水痘患者的疱疹液样本中，分离到4株VZV病毒株;病毒分高株的细胞病变(cytopathiceffect,CPE)及病毒滴度随传代次数的增加而增强;4株病毒分离株的ORF68序列与Dumas株完全一致；ORF54、ORF38的RFLP结

3、果显示.4株病毒分离株均为Bgll'Pstl'型,Oka株为BglI*PstI一型。结论成功分离的4株病毒分离株均为VZV野生毒株。关键词:水痘带状疱疹病毒;野生毒株;疫苗株;糖蛋白E；限制性片段长度多态性中图分类号：R373.1文献标志码：A文章编号：1005-5673(2017)03-0019-05DOI：10.13309/j.enki.pmi.2017.03.004IsolationandidentificationofVZVstrainfromsevenpatientssufferedfromvaricellaZHANGFu-kun*,LISan-jing,HEBao-

4、shuang,DAIIx>ng,LUJia,WANGXiang-na,TANGJing,YUChun-yao,HUOYu-qi,SHENHong项e*ResearchDepartmentofChangchunKeygeneBiologicalProductsCo.,Ltd.,Changchun130000,JilinProvince,ChinaCorrespondingauthor：SHENHong-jie,E-mail:446ll483Abstract：ObjectiveToisolateandidentifythevaricella-herpeszostervirus(VZV)str

5、ainfromtheblisterfluidofsevenpatientssufferedfromvericella.MethodsTheblisterfluidofsevenpatientswithvericellawerecollectedandculturedon2BScellssoastoisolateVZVstrainandtodeterminethevirustiter.DNAwasextracted,theopenreadingframes(ORF)68,54,38fromtheisolatedstrainsandvaccinestrain(Okastrain)wereampli

6、fiedbyPCRintnxlecedintothesequencespecificprimer.ThenucleicacidsequencesofORF68fromtheisolatedstrainsweresequencedandcomparedwithDumasstrainbyusingsoftwareDNAMAN.ORF54andORF38fromtheisolatedstrainsandOkastrainwereanalyzedwithrestrictionfragmentlengthpolymorphism(RFLP).ResultsFourVZVstrainsweresucces

7、sfullyisolatedformtheblisterfluidofsevenpatientswithvericella.TheCPEandtheviraltitersofthefourisolatedstrainsincreasedgraduallyalongwithpassages.ThenucleicacidsequencesofORF68forthefourisolatedstrainswereinconformitycompletelywithDumasstrain.TheRFLPdetectionforORF54andORF38showedthatallfourisolateds

8、trainshadBglI+PstI*,butOkastraincon-tainedBglI+PstIConclusionThefourisolatedtainedBglI+PstIConclusionThefourisolated作者简介:张夫坤(1979-),男，助理研究员，主要从事病毒性疫苗研究；李三景(1976-)，女，主任医师，主要从事传染病防治。通信作者:沈红杰，研究员，E-mail：44611483:共享第一作者strainsattributedtoVZVwildstrains.Keywords:Varicella-herpeszostervirus;Wildstrains;Va

9、ccinestrain;GlycoproteinE(gE);Restrictionfragmentlengthpolymorphism!RFLP)水痘带状疱疹病毒(varicella-herpeszostervirus,VZV)属疱疹病毒科a疱疹病亚科，首次感染可引起水痘，再次复发可引起带状疱疹J1o1974年,TAKAHASHI等从一个3岁水痘临床病人成功采集VZV样本，通过不同细胞系连续传代22次，成功筛选出一株VZV减毒病毒Oka株，用以制造水痘减毒活疫苗，并于1976年在日本被批准应用于临床。以（）如株作为毒种的水痘减毒活疫苗在全世界范围内得到了广泛的应用，并显示了很好的免疫保护效果。

10、然而，其引起的水痘带状疱疹发病的散发病例报告或让研究者担忧Oka株是否会像野生型VZV-样在人群中传播，从而引起水痘。故病毒分离株的鉴定十分必要。VZV基因组为线性双链DNA,长度约为125kb,含71个开放读码框架（openreadingframe,ORF）。其中,VZVORF68编码的糖蛋白E（glycoproteinE,gE）是VZV感染细胞的必需蛋白，同时也是VZV的主要免疫保护蛋白（,°-,o而VZV野生毒株与疫苗株的鉴别，主要通过ORF38与ORF54的限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）分析。本研究

11、主要通过对7例临床水痘患者的疱疹液临床样本，进行VZV的分离及鉴定，并对病毒分离株和疫苗株的ORF54、ORF38进行限制性片段长度多态性分析，确定病毒分离株为野毒株还是疫苗株,为当地水痘的流行病学及水痘减毒活疫苗的应用提供数据参考。1材料与方法1.1毒种和细胞VZV疫苗株（VZV-（）ka,简称Oka株）和2BS细胞株均由长春祈健生物制品有限公司保存并提供；VZVDumas株核酸序列来源于GenBank（X04370）o1.2临床样本的来源及采集样本均来自郑州市第六人民医院感染三科7例水痘患者，用无菌注射器直接抽取疱疹液或用无菌棉签藤取疱疹液，放置于3mL病毒保护液（含1%人血白蛋白的199

12、培养基）中，置于-80龙保存，临床样本来源信息见表1。表1水痘临床样本来源信息Tab.1Informationfromclinicalvericellasamples样本编号性别年龄（岁）采样方式临床诊断疫苗接种史接触史备注DXY男7无菌棉签水痘无有肠梗阻SJR女6无菌棉签水痘无无无HMF女4注射器水痘无不详无ZH男24无菌棉签水痘无无无WXL女25注射器水痘无有孕28周LAH女40注射器水痘无无无DMY男14注射器水痘无无细前性肺炎1.3 主要试剂及仪器MEM培养基购自日本日水制药株式会社;新生牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司；VZV兔多抗、辣根过氧化物酶（horseradishper

13、oxidase,HRP）标记的VZVgE单克隆抗体均由长春祈健生物制品有限公司制备；限制性核酸内切酶PstI、BglI均购自NewEnglandBio-labs公司；预混LATaq酶、病毒核酸纯化试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司。T25细胞培养瓶购自美国Coming公司；2401型CO?培养箱、Fresco21型台式离心机均购自Therm。公司。1.4病毒分离用MEM培养液（含10%新生牛血清）复苏2BS细胞至T25细胞培养瓶,6h后换液。2BS细胞生长为致密单层后，用0.25%胰蛋白酶进行消化，按照1:4比例进行传代。2BS细胞生长至致密单层后，取-80乞保存的临床样本室温夏融后接种,

14、37T吸附2h后，弃上清，补加含2%新生牛血清的MEM培养基8mL,37X.,5%C02培养。每天观察细胞病变（cylopathiceffect,CPE）,连续培养7do连续盲传5代（P1P5代），如无CPE,则判为分离阴性;出现CPE,弃上清，补加含20%新生牛血清、10%二甲基亚砚的MEM培养基，-20Y/室温冻融破碎细胞,细胞冻融液于液氮保存备用。1.5病毒滴度的检测采用蚀斑法检测P2P5代临床样本的病毒滴度。将P2-P5代临床样本分别10倍系列稀释(1：1。开始)后，接种于6孔板2BS细胞,37勾、5%C02培养7d后，以考马斯亮蓝染色并计算蚀斑数。以Oka株为阳性对照，并设置细胞对照

15、组。阳性对照组结果(4.6±0.2)也PFU/mL,空白对照组细胞无病变，试验方可判为成立。1.6病毒鉴定1.6.1病毒基因组DNA的提取取临床样本CPE及VZV病毒滴度均阳性的病毒分离株及Oka株的病毒收获液,3000g离心，收获沉淀,用注射用水复融，采用病毒核酸纯化试剂盒，按照使用说明书，提取病毒基因组DNA。1.6.2引物的设计与合成以Dumas株为模板设计引物Primer-2F/Primer-2R,根据文献13设计引物Nla/Fok与PstA/PstB,引物由吉林省库美生物有限科技公司合成，见表2。表2引物序列Tab.2Primersequences引物序列扩增片段大小(bp

16、)primer-2-Fgattacgcgttgtgatatg3884primer-2-Raacatacaccggataaaag3884Nlaggaacccctgcaccattaaa222Foktcccttcatgcccgttacat222PstAttgaacaatcacgaaccgtt350PstBcgggtgaaccgtattctgag350PCR扩增用引物Primer-2F/Primer-2R扩增病毒分离株的ORF68,用引物Nla/Fox.PstA/PstB分别扩增病毒分离株及Oka株的ORF54、ORF38。反应体系为：模板1皿，引物各1|xL,PremixTaq25皿，灭菌蒸馆水22

17、jiL；反应条件为：98Y10s,55T；30s,72X.4min,共35个循环，72X.5mino1.6.3 ORF68的测序对ORF68PCK扩增产物进行1%琼脂糖电泳检测，检测到约3900bp目标条带后,使用胶网收试剂盒，按照使用说明书对其进行切胶回收，回收后的PCR产物送吉林省库美生物科技有限公司进行测序。用ONAMAN软件对病毒分离株的ORF68序列与Dumas株序列进行比对分析。1.6.5ORF54、ORF38的限制性片段长度多态性分析对病毒分离株及Oka株的ORF54、ORF38进行限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,

18、RFLP)分析，鉴定病毒分离株是疫苗株还是野毒株。分别采用BglI、PstI限制酶对()RF54、ORF38PCR产物进行酶切，对酶切产物进行2%琼脂糖电泳检测。1.7统计学分析采用GraphPadPrism5软件进行单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1病毒分离7份临床样本，在2BS细胞连续盲传5代(PlP5代)后，其中4份样本在各代中均出现CPE,旦CPE程度随传代次数的增加而增强;3份样本在各代均未观察到CPE,见表3。表3临床样本VZV分离结果Tab.3AdaptationresultsofclinicalsamplesCPE样本编号PlP2P3P5DXY

19、-SJR-HMF+ZH-WXL+LAH+DMY+注：-：2BS细胞无CPE；+:CPE为5%10%；+:CPE为】0%-30%;+:CPE为30%-60%;+:CPEN70%c2.2病毒滴度结果显示,4份在连续盲传5代中出现CPE的样本，其P2P5代的VZV病毒滴度均为阳性，且滴度随传代次数的增加而增加；其中WXL样本在P2P5代的滴度均高于其他3个样本的相应代次(F均为5.32；P均<0.05)。3份在各代均未观察到CPE的样本其VZV病毒滴度也均为阴性，见表4。2.3ORF68的测序结果显示,4株病毒分离株的ORF68核酸序列与来源于GenBank的Dumas株ORF68核酸序列完全

20、一致，见表5。表4临床样本l>2P5代病毒滴厦Tab.4inisliterofisolatedstrainsin1*2P5病祚滴度(IgPHJ/rnL)P2P3P4P5DMY5.25±0.135.33M.135.62±0.055.87±(),14HME5.45±().125.62±0.085.78±0.035.93±0.1()I.AH5.40±0.065.34±0.105.52±0.2()5.78±0.14WXL5.55±0.025.72±0.155.82&#

21、177;0,136.10±0.12DXY阴性阴性/SJR阴性阴性/ZH阴性阴性/注:/为未进行滴度检测样本编2合成序列长度(bp)核日酸突变数DMY38840HMF38840LAH38840WXL38840222bp137bpB5hp3()()hp2(X>hp1(M)bpMarkerDMYHMI;I.AHWXLOka350bp250bpItMIbp表5VZV病毒分离株与Dumas株ORE68核酸序列的比较Tab.5ComparisonofOKE68nucleicacidsequenceofisolatedstrainsan<iDumasstrain2.4 ORF54的RF

22、LPOKF54偷切产物的电泳结果显示,4株病毒分高株与Oka株均为Bgl1型，皆可见3条核酸条带，分别位于约222bPJ37bp与85bp处，见图1。DMYHMFLAHWXLOkaMarkerI7(M>hp5()0bpl(Hlbp图1VZV病嵌分离株ORF54的BEI.P结果Fig.1RFLPresultofORF54fromisolartcdstrains2.5 ORF38的RFLPORF38酶切产物的电泳结果显示,4株病荏分离株为PsiI型，可见3条核酸条带，分别位于约350bp.250bp与100bp处；而Oka株为PsiI-型，仅在35()1)|)处见一条核酸条带,见图2。I(M

23、M)bp7«iobp5(M)bp1(MJbp3(Mlbp2<Mlbpl<M>bp图2VZV病保分离株ORF38的KELP结果Fig.2RFLPresultof()lE38fn>misolatedstrains3讨论结果显示,7份疱疹液临床样本中，在2BS细胞上连续育传5代后，其中3份临床样本各代均未观察到CPE,IL病席滴度均为阴性，可能是因为无御棉签他取疱疹液所取的样本bt少,病碇无法在2BS细胞中增殖但44份临床样本各代均观察到CPE.fi病程滴度均为阳性，经对4株病毒分离株的ORF68进行PCR扩增及测序，发现4株病毒分离株的ORF68核酸序列与来源于G

24、enBank的Dumas株ORF68核酸序列完全一致，证实其均为VZV。在病毒分离过程中，病毒分离株的CPE及病毒滴度随传代次数的增加呈增强趋势，说明随着传代次数的增加，病毒分离株已逐渐适应了2BS细胞环境。在4株病毒分离株中，WXL株各代(P2P5代)病毒滴度均明显高于其他3株分离株相应代次，可能与WXL株来源的病例曾有水痘接触史有关。VZV野生毒株与疫苗株的鉴别主要通过ORF38与ORF54的RFLP分析其中，在ORF54、38酶切位点分析，野毒株则为BgirPst1+,疫苗株为BglI+Pst1-。RFLP结果显示，成功分离的4株病毒分离株均为野生毒株，结合7例临床水痘患者的疱疹液临床样

25、本均全部来源于未接种水痘减毒活疫苗的水痘患者，同时未发现疫苗株所导致的水痘突破性病例，说明在样本来源地区水痘减毒活疫苗具有较好的保护效果。后续将对病毒分离株的基因分型做进一步研究。综上所述，成功分离的4株病毒分离株均为VZV野生毒株。本研究结果为当地水痘的流行病学及水痘减毒活疫苗的应用提供数据参考。参考文献'1WOODMJ.HistoryofvaricellazostervirusJ.Herpes,2000,7(3)：60-65.2TAKAHASHIM,OTSLKAT,OKUNOY,etal.Livevaccineusedtopreventthespreadofvaricellainc

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27、HJ,KANGHM,etal.GenotypeanalysisofORF62identifiesvariedla-zostervirusinfectionscausedbyavaccinestraininchildrenJ.ArchVirol,2017.DOI：10.1007/900705-017-3276-6.6 GALEASA,SWEETA,BENINGERP,etal.Thesafetyprofileofvaricellavaccine:aJO-yearreview.J.JInfectDis,2008,197(Suppl2)：S165-S169.7 SAUERBREIA,RUBTCOVA

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