MTT原理步骤结果分析方法及注意事项

1、MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的M

2、TT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 MTT步骤如下：1：接种细胞：用含10胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔100010000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2:培养细胞：同一般培养条件，培养35天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。3：呈色：培养35天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS <ph=7.4>配)20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内

3、培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。注意事项：（1）选择适当得细胞接种浓度。（2）避免血清干扰：一般选小于10的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。（3）设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50的时候药物的浓度。把药

4、品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入 计算公式：Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.0

5、6)/4)=-3.6025IC50=0.00025 有一个公式可供参考;lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大剂量I:lg(最大剂量/相临剂量)P:阳性反应率之和Pm:最大阳性反应率Pn:最小阳性反应率抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率 例：用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适?根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定一般每孔4000个细胞为宜，既细胞

6、浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。-一般要低于IC50，避免非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检测碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50，作用时间为36h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%，用药后一般为5-10%（Annexin V），细胞周期的亚G0峰比较明显.MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱

7、氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜（Formazan），甲臜的多少可以用酶标仪在570nm 处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT 不会有反应。MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和

8、相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。产品简介：     MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit)被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测。MTT可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成结晶状的深紫色产物formazan。在特定溶剂存在的情况下，可以被完全溶解。然后通过酶标仪可以测定570nm波长附近的吸光度。细胞增殖越多越快，则吸光度越高；细胞毒性越大，则吸光度越低。 

9、60;  本试剂盒采用了独特的Formazan溶解液配方，无需去除原有的培养液，可以直接加入Formazan溶解液溶解formazan。从而避免了由于去除培养液时formazan被部分去除而引起的误差。    本试剂盒本底低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便。    关于不同细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒的比较和选择请参考：        本试剂盒可以测定500个样品。包装清单：产品编号 产品名称 包装 C0009-1M

10、TT溶液 5mlC0009-2Formazan溶解液 55ml 说明书 1份 保存条件：    MTT溶液-20避光保存，一年有效；Formazan溶解液室温或-20保存。注意事项：    由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发的问题。一方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加PBS，水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。    MTT溶液为黄色，需避光保存，长时间光照会导致失效。当颜

11、色变为灰绿色时，请勿使用。    Formazan溶解液结冻或产生沉淀时可以37水浴孵育以促进溶解，并且必须在全部溶解并混匀后使用。    为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。1.AO吖啶橙/EB双荧光染色法是一种鉴别细胞坏死和凋亡的简便方法。AO能够进入正常细胞膜的细胞中，与DNA结合显绿色/黄绿色荧光。早期凋亡细胞的细胞膜正常，胞浆浓缩，核DNA浓缩致密，低倍镜下呈荧光亢进的圆珠状小体，高倍镜下可见不规则的块状荧光。晚期凋亡细胞胞膜通透性破坏被EB染成红色，核形态与早期凋亡细胞相似，或为浓染的红色碎片(核碎裂)或凋亡小体。而细胞坏死时，细胞膜的完整性早期即被破坏，线粒体明显肿胀，细胞体积明显增大，呈不均匀的橙红色荧光.AO/EB双染色法：待细胞长至80汇合，加入顺铂(5、10、20g/ml)作用24、48、72h后，再加入0.25胰蛋白酶及0.02EDTA消化细胞，制备单细胞悬液，调细胞浓度为107/ml，