乳猪原料检测方法汇编-六和中心化验室内部资料

1、 山东六和集团中心化验室内部资料 第一部分 :乳猪料用原料检测方法 山东六和集团技术部编辑2006-01-05目 录1: 饲用玉米脂肪酸值的测定 3 2: 油脂碘价的测定 4 3: 油脂的酸价及过氧化值的测定 . 6 4: 鱼粉中酸价的测定 . 8 5: 乳清粉中乳糖的测定 . 9 6: 油脂 TBA 值的测定方法 . 11 7: 呕吐毒素 (DON的检测 ELISA 法 . 13 8: 黄曲霉毒素的测定 ELISA 法 . 18 9: 鱼粉中组胺的测定 . 22 10:挥发性盐基氮的测定 (VBN . 24 11:饲料中免疫球蛋白 lgG 的测定 . 25 12:玉米副产品中二氧化硫残留量的

2、测定 . . 29 13:鱼粉中脲醛聚合物的鉴别 . 30 14:谷物中淀粉含量的测定 . 32 15:次粉中泥沙及矿物质的测定 . 35 16:镜检过程中的定性实验 (鱼粉、 肉骨粉、 玉米蛋白粉、 豆类蛋白粉、 大米蛋白粉 36 17:淀粉糊化度分析方法 . 39 18:大豆制品中尿素酶活性分析方法 (PH增值法 . 42 19:油脂定性试验 . 43 20:乳糖测定附表 . 45一 . 饲用玉米脂肪酸值的测定1. 试剂:1.1 KOH乙醇标准溶液 C(KOH=0.01mol/L取 KOH 溶液 C(KOH=0.1mol/L 100ml,用乙醇(95%稀释到 1 升,然后按 GB601标定

3、。1.2 酚酞指示剂:2g/l乙醇溶液1.3 无水乙醇2 步骤:将平均样品按四分法制得约 80g 样品粉碎, 过 0.45mm 孔径筛 (40目 ,立即称取 10g 样品(精确到 0.01g ,于 150ml 具塞三角瓶内, 加 50ml 无水乙醇,加塞振动 10分钟,过滤,并用无水乙醇洗 3次, 每次 15ml ,然后加酚酞 3滴,用 0.01mol/lKOH乙醇标准溶液滴定到 溶液呈微红色,同时取 90ml 乙醇作空白。3计算 :脂肪酸值 (mgKOH/100g按下式计算(V-V 0×C ×56.1脂肪酸值 ×100m式中:V -样品耗碱标准溶液的体积, ml

4、V 0空白耗碱标准溶液的体积, mlC -KOH 标准滴定溶液的浓度, mol/lm -样品质量 ,g二、油脂碘价的测定1 试剂与溶液1.1 韦氏液的配制:称取三氯化碘 7.9g 和纯碘 8.7g 分别溶于冰乙酸 中,合并两液,再用冰乙酸稀释至 1L ,贮于棕色瓶内。 1.2 KI 溶液 150g/L1.3硫代硫酸钠标液滴定溶液 C (NaS 2O 3 =0.1mol/L 1.4 三氯甲烷 CHCl 3 AR 2 步骤:按附表称取试样 (准确至 0.0002g 于干燥的碘量瓶中,加 20ml CHCl 3溶解试样,加 25.00ml 韦氏液立即加塞,以 KI 溶液封口,摇匀 后, 在 20&#

5、177;5条件下, 置黑暗处 30min (碘价在 130以上时放置 1h , 到时立即加入 KI 溶液 20ml 和水 100ml, 用 C (NaS 2O 3 =0.1mol/L硫 代硫酸钠标液滴定至浅黄色时,加入 1ml 5g/L淀粉指示剂,滴定至 兰色消失。同样条件做空白两个,取平均值。 3 结果的表示和计算: 碘价按下式计算碘价 =(V 0-V 1×C ×0.1269m×100式中:V 1试样消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积; mlV 2空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积; ml C -硫代硫酸钠标准溶液的浓度; mol/L m -试样的质量; g0.1269

6、与 1.00ml 硫代硫酸钠标准溶液 (C(NaS 2O 3 =1.000mol/L的相当的以克表 示的碘的质量。 附表:碘价数值与试样用量 三、油脂的酸价及过氧化值的测定 一 . 油脂的酸价的测定 :1 试剂与溶液1.1乙醚 -乙醇溶液(2+1配制时加入酚酞,并用碱调至中性1.2 NaOH标准滴定溶液 C (NaOH =0.1mol/L1.3酚酞指示剂 1g/L2 步骤将需用的锥形瓶烘干; 分别移取油脂上层、 中层、 下层液各 12ml置于烘干的锥形瓶中精密称量。加入 50ml 乙醚 -乙醇溶液使其溶解, 可以微热,加入酚酞指示剂 3-5滴 , 然后用 NaOH 标准溶液进行滴定 至粉红色,

7、且 1分钟不褪色为终点。同时做空白4计算 :酸价 (mgKOH/g按下式计算酸价 =C×(V-V0 ×56.1/m式中:C NaOH 标准溶液的浓度; mol/LV 消耗标准溶液的体积; mlm 样品的重量; g56.1与 1.00mlC (NaOH =1.000mol/L相当的以 mg 表示的 KOH 的质量。 5说明 :酸价是指中和 1.0g 油脂所含游离脂肪酸所需 KOH 的毫克数 , 同一 种油若酸价高,表明油脂因水解而产生更多的游离脂肪酸。二 . 油脂的过氧化值的测定1原理:油脂氧化过程产生过氧化物,与 KI 作用,生成游离碘,以淀粉 作指示剂,用硫代硫酸钠标准溶

8、液滴定。2试剂与溶液2.1三氯甲烷冰乙酸的混合液(4+62.2硫代硫酸钠标准滴定溶液 C (Na 2S 2O 3 =0.01mol/L2.3淀粉指示液 10g/L2.4碘化钾 KI AR3 步骤:称取 2- 3g(准确到 0.0002g 混匀的样品,置于 250ml 烘干的碘 量瓶中,加入 30ml 三氯甲烷冰乙酸(4+6的混合液,使样品完全 溶解,加入约 2g 的碘化钾,紧密塞好瓶塞,并轻轻振摇 30秒钟,然 后在暗处放置 3分钟,取出加 100ml 水,摇匀,立即用的硫代硫酸钠 标准溶 (C(Na 2S 2O 3 =0.01mol/L液滴定至淡黄色时,加 1ml 淀粉指 示液(10g/L

9、,继续滴定至兰色消失为终点,同样条件做空白。 4计算:过氧化值(I 2%按下式计算过氧化值(I 2% =(V 1-V 0×C ×0.1269×100/m式中: V1 -样品消耗硫代硫酸钠的体积; mlV 0 -空白消耗硫代硫酸钠的体积; mlC -硫代硫酸钠标准溶液的浓度; mol/Lm -样品的重量; g0.1269与 1.00mlC (Na 2 S2O3=1.000mol/L相当的以克表的 I2的质量 g5 过氧化值二种单位的换算 :meq/kg = I2 % * 78.9四、鱼粉中酸价的测定1 试剂与溶液1.1乙醚 -乙醇溶液(2+1配制时加入酚酞,并用碱调

10、至中性 1.2 NaOH标准滴定溶液 C (NaOH =0.05mol/L 1.3酚酞指示剂 1g/L 2 步骤称取 23g (准确到 0.0002g 鱼粉于干燥带塞的三角瓶中,加 40ml 乙醚与乙醇(2+1混合溶液,在振荡器上振摇 30min ,干过滤 于 150ml 三角瓶中, 并用少量乙醚乙醇溶液洗涤三角瓶三次, 加 3滴 的酚酞, 用氢氧化钠标准溶液 C(NaOH =0.05mol/L滴定至粉红色, 半 分钟内不褪色为终点,同样条件做空白。 3 结果的表示和计算: 酸价(mgKOH/g按下式计算酸价(mgKOH/g = 56.1×C ×(V-V 0m 式中:C N

11、aOH 标准滴定溶液的浓度; mol/L V 鱼粉消耗标准溶液的体积; ml V 0空白消耗标准溶液的体积; ml m 鱼粉样品的质量; g56.1与 1.00mlNaOH 标准滴定溶液 C(NaOH =1.000mol/L相当的以 mg 表示的 KOH 的质量。 mg五、乳清粉中乳糖的测定1 试剂与溶液1.1酒石酸铜甲液:34.639gCuSO 4溶于水,加入 0.5ml 浓 H 2SO 4,稀释 到 500ml 。酒石酸铜乙液:173g 酒石酸钾钠,加 50gNaOH ,稀释到 500ml 。 1.2 氢氧化钠溶液 c(NaOH= 1mol/L1.3硫酸铁溶液 50g/L1.4高锰酸钾标准

12、滴定溶液 c (1/5 KMnO 4 =0.1mol/L2 步骤 :称 2g 样品(准确到 0.0002g 于 200ml 烧杯中,加 50ml 水,电 炉加热到 80,加酒石酸铜甲液 10ml ,加 NaOH (1mol/L 5ml ,搅 拌后放置到室温,用水定容于 250ml 容量瓶中,摇匀,静止 1h 后干 过滤。吸取滤液 25.00ml 于三角瓶中,加 25ml 酒石酸铜甲液,再加 25ml 酒石酸铜乙液, 在电炉上加热并煮沸 2min (要保证在 3min 内煮 沸 , 取下过滤, 并用水洗涤沉淀 45次, 之后将滤纸及沉淀物 (Cu 2O 一起放入三角瓶中,加入硫酸铁(50g/L

13、25ml ,再加 25ml 水,用玻 璃棒搅拌并微热到看不到 Cu 2O 的红色为止,然后用高锰酸钾标准滴 定溶液 (c (1/5 KMnO 4 =0.1mol/L的标准溶液滴定到呈微红色为终点。 同样条件做空白3结果的表示和计算 :乳糖含量按下式计算a Cu 2O=(V-V 0×C ×71.54b 由 Cu 2O 的质量查表求乳糖的质量 m 乳 :c 样品中乳糖的含量 :乳糖 %=m 乳 /m样 ×100 式中:m 乳 样品中乳糖的质量; gm 样 -样品的质量;V -样品消耗 KMnO 4的体积; ml V 0 -空白消耗 KMnO 4的体积; ml 71.5

14、4常数;C -KMnO 4标准溶液的浓度, mol/L六、油脂 TBA 值的测定方法1原理油脂受到光、热、空气中氧的作用,发生酸败反应,分解出醛、 酸之类的化合物。 丙二醛就是分解产物的一种, 它能与硫代巴比妥酸 (TBA作用生成粉红色化合物,在 532nm 波长处有吸收高峰,利用此 性质即能测出丙二醛含量,从而推导出油脂酸败的程度。2试剂2.1硫代巴比妥酸 (TBA水溶液:准确称取 TBA 0.288g溶于水中,并 稀释至 100ml (如 TBA 不易溶解,可加热至全溶澄清,然后稀释至100ml ,相当于 0.02mol/L;2.2 三氯乙酸混合液:准确称取三氯乙酸(分析纯 7.5g 及

15、0.1g EDTA ,用水溶解,稀释至 100.00ml ;2.3 氯仿(分析纯 ;2.4 丙二醛标准溶液:称取 0.315g 1, 1, 3, 3-四乙氧基丙烷,溶 解后稀释至 1000.00ml ,此溶液每 ml 相当于丙二醛 100g ,置于冰 箱内保存。准确吸取 10ml ,稀释至 100.00ml ,此溶液每 ml 相当于丙 二醛 10微克 (g ,备用。3操作步骤3.1标准曲线的绘制准确吸取每 ml 相当于丙二醛 10g 的标准溶液 0.0、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6ml 置于纳氏比色管中,加水至总体积为 5ml ,加入 5ml TBA 溶液,然后按

16、样品测定步骤进行,测得光密度绘制标准曲 线。3.2样品测定:准确称取融化均匀的油脂样品 30.0g , 置于 100ml 具塞三角瓶内, 加入 20.0ml 三氯乙酸混合液,振摇半小时(保持油脂融溶状态,如 冷结可在 70水浴上略微加热使之融化后继续振摇用双层滤纸过 滤,除去油脂。滤液重复用双层滤纸过滤一次。准确移取上述滤液 5.0ml 置于 25ml 比色管内,加入 5.0 mlTBA溶液,混匀,加塞,置于 90水浴内保温 40min ,取出,冷却 1h , 移入小试管内, 离心 5min , 上清液倾入 25ml 纳氏比色管中, 加入 5.0ml 氯仿,摇匀,静置,分层,吸出上清液于 53

17、2nm 波长比色,对照标准 曲线得到微克数(同时作空白试验 。4 计算丙二醛含量(mg/kg按下式计算丙二醛含量(mg/kg =m C 520式中 :C -从标准曲线查得丙二醛的微克数 (ugm-样品质量(g 七 、 呕吐毒素 (DON的检测 ELISA 法测试前请仔细阅读本说明在 2 8冷藏不要冻结1. 简介 DON毒素脱氧瓜萎镰菌醇(DON , 是单端孢菌素烯烃中的一种,它通常是 由生长在谷类物品(如小麦、玉米、大麦和秣草霉菌镰红菌素生成 的。脱氧瓜萎镰菌醇的毒性效应包括:呕吐、不想进食、胃肠炎、腹 泻、免疫抑制和血液病。研究表明猪对脱氧瓜萎镰菌醇很敏感。 当脱氧瓜萎镰菌醇含量 1ppm

18、时,它们就拒绝进食。其毒性也会对其他物种产生毒性效应, 各种物种对脱氧瓜萎镰菌醇的敏感性各不相同。 研究表明脱氧瓜萎镰 菌醇会使已加工食物发生问题, 包括使可吃的谷类制品产生臭味、 对 生面团质量产生负面影响。 因此, 精确测定可能含有脱氧瓜萎镰菌醇 的食物和食品就现得十分重要。 FDA (美国食品和药品管理局已经 制定了脱氧瓜萎镰菌醇含量的强制标准。美国食品药物管理局已经颁布的 DON 毒素建议限量如下: 2. 方法原理本测试盒的测试原理是一种竞争性的直接酶联免疫吸附剂测试 方法(ELISA ,可准确检测出样品中 ppm 级的 DON 毒素。样品和标准控制液中游离的 DON 毒素与轭合物中的

19、 DON 毒素竞争抗体结合位置。 清洗后,加入底物,底物与轭合物反应出现兰色,兰色越深表明 DON 毒素越少。 将其置于微型孔阅读器中可读出透光度, 以控制标准液的 透光度作标准曲线,将样品的透光度与标准曲线比较计算出样品中 DON 毒素的准确浓度。3. 贮存要求本试剂盒存放在 28时,可以一直使用到标签上注明的到期日期。 4. 试剂与仪器4.1已提供的材料1. 48个包被了抗体的孔。2. 48个红色标记的混合孔。3. 5瓶 1.5ml 浓度为 0、 0.25、 0.5、 1、 3 ppmDON 毒素控制标准液 (黄色标 签 。4. 1瓶 DON 毒素 -HRP 轭合物溶液 (兰色标签 。5.

20、 1瓶 24ml 底物溶液 (绿色标签 。4.2需要但未提供的材料1 提取材料:a. 蒸馏水或去离子水。b. 100ml 量筒c. 150ml 的具塞三角瓶d. 滤纸e. 样品收集具塞试管f. 漏斗2. 粉碎机3. 称量为 525克的秤4. 带 450nm 滤光片的微型孔阅读器5. 200l 移液器6. 200l 吸咀7. 纸巾或等效的吸水材料8. 计时器9. 防水记号笔10. 洗瓶11. 移液器用的试剂槽12. 蒸馏水或去离子水13.C (1/2H 2SO 4 =1mol/L的硫酸终止液5. 注意事项1. 本测试盒不使用时应在 28下存放。2. 不要使用过期的测试盒。3. 不要把不同测试盒中

21、的试剂混合使用。4. 遵守正确的移液技术,包括取液前先用该液润洗一次。5. 放置时间与本说明不一致时,可能会出现错误的结果。6. 测试盒应先恢复到室温状态 (1830 后才开始使用。7. 避免测试盒在室温下长时间放置。8. 不要使测试盒冻结。9. 待测样品的 pH 值应为 68。酸碱过大的样品应进行调整。应将包括样 品提取液在内的所有废液和实验器皿进行处理(如同已被 DON 毒素污染 一样 。应始终穿戴手套和其它防护服。10. 为了避免交叉污染,每个样品应使用清洁的吸咀和玻璃器皿,并在样品 之间彻底清洗所有的玻璃器皿。6. 程序性的提示底物:底物随时可用,底物为清亮的浅兰色,如果变成了深兰,则

22、弃去。使 用时,只倒出所需量到试剂槽中, 未用完的不要再倒回试剂瓶中。 不使用时应盖 住试剂槽,以避免光的照射。7. 操作步骤7.1样品制备和提取1. 待测样品应按公认的采样技术采集。 样品应磨碎并充分混合后再提 取。测试前,将样品在 28存放。2. 将 30ml 硫酸缓缓注入 1000ml 水中,冷却摇匀,配成的硫酸 (C (1/2H 2SO 4 =1mol/L终止液。3. 取 1份代表性样品。研磨样品至至少有 75%的样品通过 20目的筛 子,颗粒尺寸大约相当于细的速溶咖啡。4. 将 10克研磨过的样品加入 50ml 水或去离子水中,用手或震荡器 剧烈混合 15分钟。5. 将静置 2-3分

23、钟,使一些物质沉淀下来。6. 用滤纸过滤出至少 5ml 的提取液。收集该滤液即为样品的待测液。7.2测试程序测试前应将所有的试剂恢复至室温(1830 。1. 从箔包中取红色标记的混合孔,放在孔架上。2. 取同样数量的包被了抗体的孔。 把暂不使用的孔放回到箔包中, 并 重新密封,以保护抗体。在带子的一端标上“ 1” ,然后放到孔架上, 将有标记的一端放在左边。不要在孔的里面和底部写标记。3. 在使用之前摇动试剂瓶,混合每种试剂。4. 从兰色标签的瓶内吸取 100l 轭合物加到每个红色标记的混合孔 内。5. 每次使用新吸咀,吸取 100l 控制标准溶液和样品液按下列顺序 加到红色标记的混合孔内6.

24、 用移液器吸入、排出 3次使孔内溶液彻底混合,吸取 100l 加 到相应的包被了抗体的孔内, 在平的表面上将板前后滑动确保充分混 合 1020秒钟,不要溅出试剂, 混合后于室温下 (1830 放置 5分钟 。弃去红色标记孔。7. 倒掉包被了抗体孔内的溶液。 在每个孔内加满蒸馏水或去离子水, 再倒出,如此重复 5次,将板朝下,在吸水材料上拍击以去除所有的 水滴。8.从绿色标签试剂瓶中倒出所需量的试剂到绿色试剂槽中。9.用移液器和新吸咀,吸取 100l 底物加到每个孔内,在平的表面 上将板前后滑动确保充分混合 1020秒钟。10. 混合后放置 2.5分钟 。11.从试剂瓶中倒出所需量的硫酸 (C

25、(1/2H 2SO 4 =1mol/L终止液到试 剂槽中。12.吸取 100l 终止液加到每个孔内,在平的表面上将板前后滑动 确保充分混合。13. 用干净的布擦净板底, 将板置于微型孔阅读器于 450nm 滤光片下 读数。由于气泡会影响结果,应削除溶液中气泡。应在加入红色终止 剂后 20分钟内完成读数。14.用 Log/logit软件计算结果。8. 特性参数检出限:0.1 ppm(10次阴性样品的平均值加 2倍标准偏差 。定量检测限:0.25 ppm(以标准曲线的最低浓度点表示 。定量范围:0.25-2.5 ppm(大于 2.5 ppm 时 , 见样品制备和提取程序 八、黄曲霉毒素的测定 EL

26、ISA 法测试前请仔细阅读本说明在 2 8冷藏不要冻结1. 简介 黄曲霉毒素黄曲霉毒素是一种剧毒且致癌的物质, 它是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌 A 的某 些菌株产生的。黄曲霉毒素有四种类型:B1, B2, G1和 G2。黄曲霉毒素 B1是毒 性最大且最常有的。最容易产生黄曲霉毒素污染的物质是谷物、花生、棉子、高 梁和大多数的树果。动物食入过量黄曲霉毒素的影响从慢性健康直到死亡, 已经证明黄曲霉毒素 能引起肝损坏或癌症、降低奶和蛋的产出、免疫抑制和干扰再生效率。美国食品药物管理局已经规定了食品和饲料中最大黄曲霉毒素限量。因此, 准确测定黄曲霉毒素的含量, 对于监测可能发生黄曲霉毒素污染的食品和饲料的

27、 质量来说,是非常重要的。测试程序包括仔细的采样、化学提取、卫生学评价和 定量分析。 2. 方法原理本 测 试 盒 的 测 试 原 理是 一 种 竞 争 性 的 直 接酶 联 免 疫 吸 附 剂 测 试 方 法 (ELISA , 可准确检测出样品中 ppb 级的黄曲霉毒素。 样品和标准控制液中游离 的黄曲霉毒素与轭合物中的黄曲霉毒素竞争抗体结合位置。清洗后,加入底物, 底物与轭合物反应出现兰色, 兰色越深表明黄曲霉毒素越少。 将其置于微型孔阅 读器中可读出透光度, 以控制标准液的透光度作标准曲线, 将样品的透光度与标 准曲线比较计算出样品中黄曲霉毒素的准确浓度。3. 贮存要求本试剂盒存放在 2

28、8时,可以一直使用到标签上注明的到期日期。 4. 试剂与仪器4.1提供的材料4.2需要但未提供的材料a. 70%甲醇溶液b. 100ml 量筒c. 150ml 的具塞三角瓶d. 滤纸e. 样品收集具塞试管f. 漏斗5. 注意事项5.1 甲醇易燃, 其容器应密闭并远离热、 火花、 明火和烟。 如果吞下或吸入蒸气, 它是有毒的。应避免与皮肤接触。5.2 本测试盒不使用时应在 28下存放。5.3 不要使用过期的测试盒。5.4 不要把不同测试盒中的试剂混合使用。5.5 遵守正确的移液技术,包括取液前先用该液润洗一次。5.6 放置时间与本说明不一致时,可能会出现错误的结果。5.7 测试盒应先恢复到室温状

29、态 (1830 后才开始使用。5.8 避免测试盒在室温下长时间放置。5.9 不要使测试盒冻结。5.10应将包括样品提取液在内的所有废液和实验器皿进行处理(如同已被黄曲 霉毒素污染一样 。应始终穿戴手套和其它防护服。5.11为了避免交叉污染,每个样品应使用清洁的吸咀和玻璃器皿,并在样品之 间彻底清洗所有的玻璃器皿。5.12待测样品的 pH 值应为 68。酸碱过大的样品应进行调整。关于 pH 值的调 整,请与 Neogen 代表或技术服务部门联系。6. 程序性的提示K-兰底物随时可用,底物为清亮的浅兰色,如果变成了深兰,则弃去。使用 时, 只倒出所需量到试剂槽中, 未用完的不要再倒回试剂瓶中。 不

30、使用时应盖住 试剂槽,以避免光的照射。7. 操作步骤7.1样品制备和提取待测样品应按公认的采样技术采集。 样品应磨碎并充分混合后再提取。 测试 前,将样品在 28存放。按以下程序进行:1 将 7份分析级甲醇与 3份蒸馏水或去离子水混合配成 70%的甲醇溶液。2 将 30ml 硫酸缓缓注入 1000ml 水中, 冷却摇匀, 配成硫酸 (C(1/2H 2 SO4=1mol/L的终止液。3取 1份代表性样品。研磨样品至至少有 75%的样品通过 20目的筛子,颗粒尺 寸大约相当于细的速溶咖啡。4把 5克研磨过的样品加入到 25ml 70%的甲醇中,然后用力摇动 15分钟。 5用滤纸过滤出至少 5ml

31、的提取液。该滤液即为样品的待测液。6该待测液即可用于测试。7.2测试程序测试前应将所有的试剂恢复至室温(1830 。1. 从箔包中取红色标记混合孔,放在孔架上。2. 取同样数量的包被了抗体的孔。把暂不使用的孔放回到箔包中,并重新密封, 以保护抗体。3. 在使用之前摇动试剂瓶,混合每种试剂。4. 从兰色标签瓶内吸取 100l 轭合物加到每个红色标记的混合孔内。 弃去吸咀。5. 每次使用新吸咀,吸取 100l 控制标准溶液和样品液按下列顺序加到红色标 记的混合孔内6. 用移液器吸入、排出 3次使孔内溶液彻底混合,吸取 100l 加到相应的包被 了抗体的孔内,在平的表面上将板前后滑动确保充分混合 1

32、020秒钟,不要溅 出试剂, 混合后于室温下 (1830 放置 2分钟 。7. 倒掉包被了抗体孔内的溶液。 在每个孔内加满蒸馏水或去离子水, 再倒掉, 如 此重复 5次,将板朝下,在吸水材料上拍击以去除所有的水滴。8. 从绿色试剂瓶中倒出所需量的试剂到试剂槽中。9. 用移液器和新吸咀,吸取 100l 底物加到每个孔内,在平的表面上将板前后 滑动确保充分混合 1020秒钟。10. 混合后放置 1.5分钟 。11. 从试剂瓶中倒出所需量的硫酸 (C(1/2H 2 SO4=1mol/L终止液到试剂槽中。12. 用移液器吸取 100l 终止液加到每个孔内, 在平的表面上将板前后滑动确保 充分混合。13

33、. 用干净的布擦净板底,将板置于微型孔阅读器于 450nm 滤光片下读数。由于 气泡会影响结果,应削除溶液中气泡。应在加入终止液后 20分钟内完成读数。 14. 用 Log/logit软件计算结果。8. 特性参数检出限:2ppb(10次阴性样品的平均值加 2倍标准偏差 。 定量检测限:5ppb(以标准曲线的最低浓度点表示 。 定量范围:5-50 ppb(大于 50 ppb时应稀释 九 、 鱼粉中组胺的测定原理简介 :鱼粉中组胺用三氯乙酸提取,之后调 PH=9,将游离的组胺用正戊 醇提取出,之后再用 HCl 反萃取,用偶氮试剂显色。组胺 +三氯乙酸盐 (溶于水 -PH=9-组胺 (溶于正戊醇 -

34、HCl-正戊醇 (组 胺溶于稀 HCl 1试剂与溶液1.1偶氮试剂的配制甲液:称取 0.5g 对硝基苯胺,加 5ml 盐酸(1+1溶解,再加水释到 200ml ,置 冰箱中(28度保存。乙液:亚硝酸钠溶液 5g/l,临用现配甲液 5ml 、乙液 40ml 混合后立刻使用。1. 2三氯乙酸 100 g/L1.3氢氧化钠 250g/L1.4盐酸 1mol/L1.5正戊醇 分析纯1. 6碳酸氢钠溶液 50g/L1.7磷酸组胺(Sigma 公司步骤2.1样品处理称取 1-3克鱼粉于具塞三角瓶内, 加入 25.0ml 三氯乙酸 (100g/L 每隔 30分钟摇动一次, 提取 3小时, 过滤, 取滤液 2

35、.00ml 或 1.00ml 于 15ml 试管内,加氢氧化钠(250g/L 5滴,振荡一下,再加 5ml 正戊醇振荡 2分钟,静止分层(如出现乳化现象可滴加 2-3滴无水 乙醇 ,用移液枪小心吸取上清液(正戊醇层于 50ml 分液漏斗内, 下层沉淀再下层沉淀再分别用正戊醇 5ml 、 3ml 、 3ml 反萃取 3次。将 正戊醇全部收集到 50ml 分液漏内 , 分别用盐酸 (1mol/L6 ml、 6 ml、3 ml反萃取 3次 , 收集水相(下层于 20ml 刻度试管内,用水定容 至刻度 (20.00ml,摇匀,吸取 1.00ml (或 2.00ml 盐酸提取液于 10 ml 比色管中,

36、加入碳酸氢钠溶液(50g/L 3.0ml 摇匀,振荡下加 入偶氮试剂 3.0ml ,用水定容到刻度,室温下显色 10min ,用 1cm 比 色皿于 480nm 下测定吸光度。2.2标准曲线称取磷酸组胺样品(Sigma 公司 2.7671mg ,置于 100ml 容量瓶 内,用水溶解并定容到刻度,此液组胺含量为 10ug/ml,分别取此标 液 0.00、 1.00、 2.00、 4.00、 6.00ml 于 5支 10ml 比色管内,各加盐 酸(1mol/L 1.0ml ,振荡,用水定容到刻度,摇匀后放置 10min (室 温下 ,用 1cm 比色皿于 480nm 下测吸光值。参比液:试剂空白

37、3计算鱼粉中组胺按下式计算公式: 实例 :鱼粉 2.3455,取三氯乙酸提取液 1.00ml ,吸光度 A=0.257标准曲线 :A=0.012380*C+0.01310计算 : C =(A-0.0131/0.012380=19.70ug组胺 =(19.70*100/(2.3455/25*(1.0/15*1000=315mg/100g=3150ppm应用:进口白鱼粉:组胺 <10mg/100g(1-5mg/100g进口水产级蒸汽鱼粉 <100mg/100g(50mg/100g优质国产鱼粉 <150mg/100g(50-150mg/100g新鲜度差的鱼粉 (国产 , 进口 组胺

38、 200340mg/100g用于乳猪料的鱼粉 组胺 <100mg/100g十 、 挥发性盐基氮的测定 (VBN原理简介 :蛋白质分解时,氨基酸脱胺基生成氨,氨基酸脱羧基生成胺,氨 与胺 (挥发性的胺 在碱液 (氧化镁 中被蒸发出来, 用硼酸吸收, 用标准盐酸反滴 定,测出其含量。1试剂与溶液1.1氧化镁溶液 10g/L2. 步 骤称取 5-10g 样品于 250ml 具塞三角瓶内, 加入 100.0ml 水, 振荡 30min ,过滤,取虑液 10.00ml ,按粗蛋白蒸馏操作,但加入的碱为 氧化镁溶液(10g/L 7-10ml 。3. 计算:挥发性盐基氮(VBN (mg/100g按下式

39、计算VBN (mg/100g = C(V-V 0 *14/m*(10/100 *100 实例 :鱼粉样品 8.6706g , V HCl =0.0200mol/L V=3.93ml V0=0.15ml VBN=0.0200*14* (3.93-0.15/8.6706*(10/100*100 =122.1mg/100g应用 :新鲜度好的鱼粉 VBN<100mg/100g(40-80 mg/100g新鲜度差的鱼粉 VBN>150mg/100g(180-350 mg/100g乳猪料鱼粉 VBN<100mg/100g十一 、 饲料中免疫球蛋白 lgG 的测定 (高效液相色谱法 1 范

40、围本标准规定了用高效液相色谱法仪测定饲料中免疫球蛋白 IgG 含量的方法本标准适用配合饲料、浓缩饲料、含 Ig 的饲料原料(包括血浆 蛋白粉、鸡蛋粉等中免疫球蛋白 IgG 的测定本方法检出限:当取样 1g ,稀释至 25ml ,进样量 20ul ,检出浓 度为 0.2mg/ml2 原理根据高效亲和色谱的原理,在磷酸盐缓冲液条件下免疫球蛋白 IgG 与配基连接, 在 PH2.5的盐酸甘氨酸条件下洗脱免疫球蛋白 IgG 。 3 试剂除非另有说明, 在分析中仅使用确认为分析纯的试剂, 水为去离 子水或相当纯度的水,应符合 CB/T6682三级用水的规定3.1磷酸二氢钾3.2 磷酸氢二钾3.3流动相

41、A :PH6.5, 0.05mol/L磷酸盐缓冲液3.4流动相 B :PH2.5, 0.05mol/L甘氨酸盐酸缓冲液3.5 IgG储备标准液:称取 IgG 标准品(Sigma 公司 0.0100g ,用流动相 A (3.3溶 解并定容至 10ml ,摇匀,浓度为 1.0mg/ml3.6 IgG工作标准溶液:取 IgG 标准储备液,用流动相 A (3.3稀释成含 IgG 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0mg/ml的标准系列。临用时配制。4 仪器和设备4.1 实验室常用仪器设备4.2 PH计4.3超纯水装置4.4匀浆机4.5高效液相色谱仪:具紫外检测器和梯度洗脱装置5 试样制备按

42、GB/T14699饲料采样,选取饲料样品至少 500g ,四分法缩减 至少 100g , 磨碎, 通过 0.28 um(80目 孔筛, 混匀, 装入密闭容器中, 避光低温保存备用。6 分析步骤6.1试样处理:称取一定量试样(精确至 0.0001 ,配合饲料、浓缩饲料时,称 取试样 25g;血浆蛋白粉称取试样 0.1g ;鸡蛋粉称取试样 0.5g ,于 茄形瓶中,准确加入 25ml 流动相 A (3.3 ,用匀浆机匀浆 5分钟, 取溶液 10ml 于离心管中, 以 3500 r/min离心 10min , 通过 0.45um 微 孔滤膜后进样6.2 测定:色谱柱:Pharmacia HI-Tra

43、p Protein G柱, 1 ml波长:280nm进样量:20ul梯度洗脱见表 1表 1 6.2. 3测定先用 5倍柱体积的重蒸馏水或去离子水洗柱,再用 10倍柱体积 流动相 A (3.3平衡柱,按洗脱程序进行洗脱。分别取 6.1试样处理液和 3.6标准工作液进行测定,以色谱峰面积积 分值做单点或多点校准定量。7 结果计算7.1试样中 IgG 含量 (g/100g按下式计算:P 1×V ×c ×V st ×100P st ×m ×Vi ×V 1×100式(1中:-试样中 IgG 含量, g/100g;=Vst 标

44、准工作液进样体积, ul ;P st 试样峰面积值;Vi -试样进样体积; ul ;V -试样体积, ml ;m -称取试样的质量, g ;7.2 平行测定结果用算术平行值表示,保留小数点后两位有效数字。8 重复性在重复性条件下获得的两次独立测试结果的测定值的绝对差值 不得超过算术平均值的 15%。十二 、 玉米副产品中二氧化硫残留量的测定 方法 1:GB/T5009.34-1996方法 2:称取样品 10g 于三角烧瓶内 , 加入少量水 (约 10ml, 加入 20ml 浓盐 酸 ,5g 锌粉 , 瓶口用乙酸铅试纸扎紧 , 放在沸水浴上加热 , 若瓶中变黑则 含 SO 2 , 标准样品可用无

45、水亚硫酸钠 (Na2SO 3 代替 , 同上操作 , 根据黑班 的大小 , 确认含量 .方法 3:称样品 20g 于具塞三角瓶内 , 准确加入 100ml 水 , 振荡 5分钟 , 静止 待瓶内液体澄清后 , 准确吸取上清液 20ml, 置于 250ml 碘量瓶内 , 加入 1mol/L NaCl 25ml, 振荡 2分钟 , 静止 10分钟 , 然后加入硫酸 (1+310ml,边 加 边 振 荡 , 之 后 加 淀 粉 (10g/l1ml,用 碘 标 准 滴 定 溶 液 (C(1/2I 2=0.1mol/L滴定到溶液呈兰色 , 同时作空白试验 .SO 2 % =C×(V-V0 &#

46、215;0.032/(m×1/5×100十三 、 鱼粉中脲醛聚合物的鉴别 1原理脲醛聚合物在浓硫酸的作用下分解成甲醛与氨,甲醛与变色酸 (铬变酸 ,1.8 二羟基萘 3.6二磺酸的浓硫酸溶液一起微热,形 成一种紫色 紫红色化合物2试验部分试剂与仪器立体显微镜(160倍可连续变焦,带光源眼科镊子烧杯 50 ml变色酸 2g/L称取变色酸 0.2g 于 200ml 干燥的烧杯中,加入 100ml 浓硫酸, 电炉上微热 (50-60 2min 并搅拌使之溶解,冷却后,移入 120ml 棕 色滴瓶内。试验步骤取约 3g 试样于烧杯中,用石油醚(或乙醚脱脂,吹干溶剂后 将样品移至培养

47、皿内,在体视镜下(放大倍数为 10 20倍将白色 或浅黄色易碎的无定形固体可疑物,用眼科镊子小心夹取数粒于 50ml 干燥烧杯内,再将烧杯放到体视镜下,确认可疑物已移放到烧 杯内, 然后滴加 0.5 1ml 变色酸, 并把烧杯放在电炉上微热 1 2min , 如溶液变成紫色(或紫红色 ,则样品中含有脲醛聚合物“蛋白精” 。 3结果与讨论反应的干扰情况和检出限量变色酸的浓硫酸溶液对乙醛、丙醛、丁醛、异丁醛、异戊醛、庚 醛、巴豆醛、水合氯醛、乙二醛及芳香族醛类物均无此反应,与甘油 醛、糠醛、阿拉伯糖、果糖及蔗糖反应显黄色,其它糖类、丙酮及羧 酸类都不与变色酸的浓硫酸溶液发生反应。此方法的检出限量为

48、 0.05mg (脲醛聚合物 加热温度滴加变色酸的浓硫酸溶液后,加热的温度应在 150 以下,温 度过高部分“蛋白精”被炭化成黑色,影响判断。夹取可疑物时应注意的问题由于 “蛋白精” 的粒度很小, 而且易碎, 虽然在体视镜下看到了, 镊子也夹到了,但在转移到烧杯的过程中易丢失,因此,在夹取了数 粒后, 要将烧杯放到体视镜下确认可疑物已放到烧杯中, 并轻轻振动 烧杯或用探针拨动可疑物, 使之集中在烧杯底部的某个点上, 滴加变 色酸时要对准此点。依据氨基酸总量来判断是否掺有“蛋白精”通常根据鱼粉氨基酸总量明显偏低(小于粗蛋白质的 85% ,而 水溶性非蛋白氮 (NPN为阴性来判断鱼粉中有脲醛聚合物

49、“蛋白精” , 这并不能说明样品中一定含有脲醛聚合物“蛋白精” ,只能证实含有 难溶性的非蛋白氮 (NPN。3.5 此方法也适用于肉骨粉、 玉米蛋白粉、 豆类蛋白粉、 大米蛋白粉 中蛋白精的检测十四 、 谷物中淀粉含量的测定1 试剂与溶液1.1 酒石酸铜甲液 (菲林甲液 :34.639gCuSO 4溶于水,加入 0.5ml 浓 H 2SO 4,稀释到 500ml 。1.2 酒石酸铜乙液 (菲林乙液 :173g 酒石酸钾钠,加 50gNaOH ,稀 释到 500ml 。 1.2 氢氧化钠溶液 c(NaOH= 1mol/L1.3 硫酸铁溶液 50g/L1.4 高锰酸钾标准滴定溶液 c (1/5 K

50、MnO 4 =0.1mol/L1.5 乙醇溶液 85% v/v1.6 HCl 1+1 和 1+3NaOH 溶液 40%乙酸铅溶液 20%硫酸钠 10%2 步骤 :称取样品(粉碎过 40目筛 2.05.0g ,准确至 0.0002g ,置于 放有慢速滤纸的漏斗中,用 30ml 乙醚分三次洗去样品中脂肪,再用 150ml 85%乙醇溶液分数次洗涤残渣,以除去可溶性糖类物质,滤干 乙醇溶液, 将滤纸连同残渣一并转移至 250ml 锥形瓶中, 加 100ml 水, 加 30ml (1+1 HCl ,在沸水浴上回流 2h ,回流完毕后,立即在流水 中冷却,待样品水解液冷却完全后,加 3滴甲基红指示剂,先

51、用 40%NaOH溶液调至黄色,再用 (1+3的 HCl 调至水解液刚变红色为宜, 使水解液的 PH 值约为 5,然后加 20ml 20%的乙酸铅溶液,摇匀,放 置 10min ,再加 20ml 10%的硫酸钠溶液,摇匀后,将全部溶液及残渣 转入 500ml 容量瓶中, 用水洗涤锥形瓶, 洗液合并于容量瓶中, 定容, 摇匀,过滤,弃去初滤液 20ml ,滤液供测定用。吸取 25.00ml 滤液于三角瓶中, 加 25ml 菲林甲液, 再加 25ml 菲 林乙液,在电炉上加热 (在 3min 内煮沸 并煮沸 2min ,取下过滤,并 用水洗涤沉淀 45次,之后将滤纸及沉淀物一起放入三角瓶内,加 入

52、硫酸铁(50g/L 25ml ,再加 25ml 水,用玻璃棒搅拌到看不到 Cu 2O 的红色为止,然后用高锰酸钾标准溶液 C(1/5KMnO4 =0.1mol/L滴 定到呈微红色 30s 不褪色为终点。同样条件做空白。3计算 :以质量百分含量表示的淀粉含量按下式计算:(1 C u 20=(V-V 0×C ×71.54(2 用 Cu 20的质量查表求转化糖的质量:淀粉含量 % =转化糖×0.9m×25.00/250.0×100式中: V -样品消耗 KMnO 4的体积; ml V 0空白消耗 KMnO 4的体积; ml , m -试样的质量 ,g

53、十五 、 次粉中泥沙及矿物质的测定 1 步骤:称取 20g 样品(准确至 0.1g 于 250ml 干燥的分液漏斗中,加 约 100ml 的四氯化碳,振荡几分钟,静止 0.5h 以上,小心地将下层 沉淀物放出到已在 105烘至恒重的小烧杯中,水浴上蒸干溶剂后, 放到 105烘箱内烘 0.5h ,取出,冷却,称重。2 沉淀物分析(定性如沉淀物为白色、灰白色物质,且不溶于盐酸,则为滑石粉;反 之,沉淀溶于盐酸,并放出大量的气泡,则为石粉。如沉淀物外观如泥砂状物质,则沉淀为混入或掺入的泥砂。 如沉淀外观很白,并有荧光性,则沉淀物为增白剂。3 计算:沉淀物 % = m 2-m 1m×100

54、式中:m 2烘后沉淀物+烧杯的质量; gm 1烧杯的质量; gm 样品的质量; g说明 :此方法也适用于豆粕、棉粕及菜粕中泥砂的测定 。十六 、 鱼粉、肉骨粉、玉米蛋白粉、豆类蛋白粉、大米蛋白粉 镜检过程中的定性实验定性检查A . 掺入植物类物质 (如小麦麸、 稻谷粉、 豆类蛋白粉和大米蛋白粉 试剂:碘 -碘化钾溶液配制:称 1g 的碘及 5g 碘化钾于烧杯内,加 100ml 水搅拌 2分钟,待 溶解后将其移入 120ml 棕色的滴瓶内。步骤:取约 5g 样品放在烧杯内,加约 70ml 水,在电炉上煮沸,取下 静止 2分钟, 滴加碘-碘化钾溶液1ml , 如溶液变成蓝色则掺 入植物性的物质。B

55、. 掺入尿素试剂:(1生黄豆粉 :将大豆磨成粉末(注意 :防止粉碎中升温 (2酚红 :1g/L。 称取酚红 (苯酚红 0.1g 溶于 100ml 乙醇中。 步骤:取约 0.5g 鱼粉样品,于 50ml 比色管内,再加约 0.1-0.2g 生黄豆粉, 3-5滴酚红, 40ml 水,塞好塞子,摇动 30秒,静止, 如溶液变成红色,则样品中掺入尿素。C. 掺入铵盐类物质(氨化铵,碳酸氢铵试剂 (130%氢氧化钠溶液 : 称30g 氢氧化钠加70ml 水。 (2 PH 试纸步骤:取鱼粉 3-5g 于 100ml 烧杯内,表皿内侧沾一条湿的 PH 试纸, 向烧杯内加约 5-10ml 氢氧化钠,将表皿迅速

56、盖上,如试纸迅速变蓝,则含铵盐。D. 掺入蛋白精(脲醛聚合物试剂 :变色酸 (0.1%硫酸溶液 称取 0.1g 变色酸于干燥的烧杯内, 加 入 100 ml浓硫酸,电炉上加热到(70-80 ,待溶解后,降 温,移入 120 ml棕色的滴瓶内。步骤 : 将可疑物从显微镜下夹出数粒于干燥的小烧杯内, 滴加约 1 ml 变色酸,电炉上加热到刚刚产生微烟,取下,加入 20 -30ml水,如变成紫色,则样品中有蛋白精。E. 掺入植物性物质(含大量粗纤维类物质:如锯末、稻草、麦芽根 试剂 :(1 间苯三酚 2%:称间苯三酚 2 g,加 100 95%乙醇,溶解后 放入棕色滴瓶内。(2 浓盐酸 36% 分析纯试剂步骤:称 1-2g 鱼粉于培养皿内, 滴加间苯三酚使样品湿润, 放置 5-10分钟后,滴加浓盐酸约 0.5ml ,放置