第一章实验室及基本操作

1、第一章实验室及基本操作第一节第一节 组织培养实验室的建立组织培养实验室的建立在进行植物组织培养工作之前，在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模实验室的大小取决于工作的目的和规模 1. 以工厂化生产为目的，实验室规模太小，以工厂化生产为目的，实验室规模太小， 则会限制生产影响效率。则会限制生产影响效率。 2. 在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来设计，在设计组织培养

2、实验室时，应按组织培养程序来设计， 避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。 植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的，植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的， 要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具， 同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。一、组织培养实验室布局的总体要求一、组织培养实验室布局的总体要求 便于隔离便于隔离 便于操作便于操作 便于灭菌便于灭菌 便于观察便于观察二、构成二、构成 化学实验室（洗涤室）化学实验室（洗涤室） 接种室接种室 无菌培养室无

3、菌培养室 灭菌室灭菌室 细胞学观测室（可以不设）细胞学观测室（可以不设）三、主要单元功能介绍三、主要单元功能介绍接种室接种室(外设缓冲间外设缓冲间)无菌接种箱无菌接种箱1. 无菌操作室无菌操作室 材料的消毒、接种，继代。材料的消毒、接种，继代。 内置超净工作台或接种箱。内置超净工作台或接种箱。 外设缓冲间，外设缓冲间， 放置拖鞋、工作服、工作帽等。放置拖鞋、工作服、工作帽等。2. 培养室培养室满足材料的生长（光、热、水、气）。满足材料的生长（光、热、水、气）。 要求：要求： 保温隔热；保温隔热； 控温、控光；控温、控光； 暗室。暗室。 设备：培养架、设备：培养架、 加温设备、降温设备加温设备、

4、降温设备3. 化学实验室化学实验室 器皿的洗涤、干燥、保存；器皿的洗涤、干燥、保存； 药品称量、溶解、培养基的配置；药品称量、溶解、培养基的配置； 植物材料预处理，培养材料的观察分析。植物材料预处理，培养材料的观察分析。 主要设备主要设备 工作台、药品柜、冰箱、烘箱、天平、蒸馏水器。工作台、药品柜、冰箱、烘箱、天平、蒸馏水器。 4. 灭菌室灭菌室 对培养基进行灭菌。对培养基进行灭菌。 5. 细胞学实验室细胞学实验室 培养材料的分析照相，培养材料的分析照相， 设备：显微镜、解剖镜、染色设备。设备：显微镜、解剖镜、染色设备。基本实验室布局平面图实验台搁架培养架培养架培养架培养架药品及仪器柜无菌台无

5、菌台搁架拉窗冰箱搁 架水槽电炉门准备室准备室缓冲室缓冲室无菌室无菌室培养室培养室四、常用仪器设备四、常用仪器设备（一）仪器（一）仪器 1. 天平天平 1/10、1/100药物天平：大量元素、药物天平：大量元素、 蔗糖、琼脂。蔗糖、琼脂。 1/10000分析天平：维生素、分析天平：维生素、 激素、微量元素、微量附加物。激素、微量元素、微量附加物。 2. 灭菌锅灭菌锅 3. 烘箱（干燥箱）烘箱（干燥箱） 80-100：烘干物品、测定植物组织干物质重。：烘干物品、测定植物组织干物质重。 150-160：干热灭菌（不超过：干热灭菌（不超过175）；）；4. 冰箱冰箱 有机试剂和母液的储藏；有机试剂和母

6、液的储藏； 细胞及其他材料的冷藏保存；细胞及其他材料的冷藏保存； 植物材料的处理（低植物材料的处理（低 温打破休眠）。温打破休眠）。5. 酸度计酸度计 对培养基对培养基pH值进行调整。值进行调整。 （一般用（一般用pH4-7的精密试纸代替）的精密试纸代替）6. 双筒实体显微镜（解剖镜）双筒实体显微镜（解剖镜） 茎尖的剥取（分生组织）；茎尖的剥取（分生组织）； 对植物材料的隔瓶观测。对植物材料的隔瓶观测。7. 蒸馏水器蒸馏水器 减小实验中的偶然因素。减小实验中的偶然因素。8. 空调空调 温度变化差异不大。温度变化差异不大。蒸馏水器蒸馏水器9. 震荡培养机和旋转培养机震荡培养机和旋转培养机 液体培

7、养。液体培养。10. 培养箱培养箱摇床摇床光照培养箱光照培养箱l1. 玻璃器皿玻璃器皿l 培养器皿培养器皿 原则：无毒透光；原则：无毒透光；l 试管：试管：215，2.515，315。l 三角瓶：三角瓶：50ml，100ml，150ml，200ml。（主要用于继代培养）。（主要用于继代培养）l 培养皿：培养皿：原生质体、游离细胞、花药等的培养；原生质体、游离细胞、花药等的培养；l 无菌种子的萌发；无菌种子的萌发；l 材料的分离；材料的分离；l 无菌滤纸的消毒灭菌无菌滤纸的消毒灭菌l l 封闭物防止培养基干燥和杜绝污染、无毒透气（棉塞、菌膜）封闭物防止培养基干燥和杜绝污染、无毒透气（棉塞、菌膜）

8、（二）必要器皿（二）必要器皿l盛装器皿盛装器皿l 烧杯、试剂瓶，烧杯、试剂瓶，l 药品的溶解和储存。药品的溶解和储存。l计量器皿计量器皿l 量筒：量筒： 10ml、25ml、50ml、100ml、200ml、500ml、1000ml。l 容量瓶：容量瓶：25ml，50ml，100ml，250ml，500ml，1000ml。l 移液管：，移液管：，1ml，2ml，5ml，10ml。l其他其他l 漏斗漏斗l 玻棒玻棒l 滴瓶滴瓶2. 金属器皿金属器皿 镊子：镊子： 剪刀：剪刀： 分离器械：手术刀、芽接刀分离器械：手术刀、芽接刀 l大量元素；大量元素；l微量元素；微量元素；l维生素、氨基酸等（有机附

9、加物）。维生素、氨基酸等（有机附加物）。l糖类：蔗糖、葡萄糖等。糖类：蔗糖、葡萄糖等。l凝固剂：琼脂等。凝固剂：琼脂等。l激素激素l生长素类：生长素类：IAA、IBA、NAA、2，4-D。l细胞分裂素类：细胞分裂素类：6-BA、KT、ZTl赤霉素类：赤霉素类：GA3（三）常备药品（三）常备药品一、培养基及其配制一、培养基及其配制（一）概念（一）概念MS + NAA 0.2 + 6-BA 2 + 蔗糖蔗糖 第二节第二节 植物组织培养的一般技术植物组织培养的一般技术单位：单位：mg/LMSmg/L2、根据成分、根据成分天然培养基：动、植物的组织或组织的汁配成的培养基。天然培养基：动、植物的组织或组

10、织的汁配成的培养基。化学成分还不清楚或不恒定。化学成分还不清楚或不恒定。4、根据功能、根据功能 愈伤组织培养基、花粉培养基、茎尖培养基、愈伤组织培养基、花粉培养基、茎尖培养基、 脱分化培养基、增殖培养基、分化培养基。脱分化培养基、增殖培养基、分化培养基。1）脱分化培养基）脱分化培养基 （mg/L）高浓度生长素高浓度生长素 烟草：烟草：MS + 水解蛋白水解蛋白 500 + 2,4-D 1-2。 水稻：水稻：MS + 2,4-D 1。多量生长素多量生长素 + 少量细胞分裂素少量细胞分裂素 烟叶：烟叶：MS + 水解蛋白水解蛋白 哈密瓜：哈密瓜：多量细胞分裂素多量细胞分裂素 + 少量生长素少量生长

11、素 天竺葵：天竺葵：MS + NAA 0.2 + 6-BA 22）继代培养基）继代培养基在脱分化培养基上降低生长素的量、在脱分化培养基上降低生长素的量、或用原脱分化培养基。或用原脱分化培养基。（三）培养基成分（三）培养基成分功能功能 组成各种化合物，参与机体的建成，成为结构物质。组成各种化合物，参与机体的建成，成为结构物质。 构成一些生理活性物质，参与活跃的新陈代谢。构成一些生理活性物质，参与活跃的新陈代谢。 元素之间互相协调，元素之间互相协调， 以维持离子浓度的平衡、胶体稳定、电化学平衡等作用。以维持离子浓度的平衡、胶体稳定、电化学平衡等作用。注：不同器官的发生，需要营养元素的浓度不同。注：

12、不同器官的发生，需要营养元素的浓度不同。1. 无机盐无机盐大量元素：碳、氢、氧、氮、磷、钾、钙、镁、硫、硅大量元素：碳、氢、氧、氮、磷、钾、钙、镁、硫、硅（-） 。 3+7种，种， 干重干重0.01-10%微量元素：铁、硼、锰、锌、铜、钼、氯、镍微量元素：铁、硼、锰、锌、铜、钼、氯、镍（-） 、钠、钠（-） 。 9种，种， 干重干重0.00001-0.01% I（+） 、 Co（+）。必需元素的生理作用，必需元素的生理作用， 略。略。2. 有机物有机物1）维生素：）维生素：B1（盐酸硫胺素）、（盐酸硫胺素）、B3（烟酸）、（烟酸）、B6（盐酸吡哆醇）。（盐酸吡哆醇）。维生素主要是以各种辅酶的形

13、式参加酶的形成，维生素主要是以各种辅酶的形式参加酶的形成， 以及蛋白质、脂肪的代谢等重要生命活动。以及蛋白质、脂肪的代谢等重要生命活动。 对生长和分化有促进作用。对生长和分化有促进作用。虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素，虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素，但在数量上还明显不足，但在数量上还明显不足，通常需加入通常需加入1至数种维生素，以便获良好的生长至数种维生素，以便获良好的生长.。2）氨基酸）氨基酸 氨基酸是蛋白质的组成成分，氨基酸是蛋白质的组成成分， 也是一种有机氮源，可直接被细胞吸收利用也是一种有机氮源，可直接被细胞吸收利用 。 常用的有甘氨酸、精氨酸、

14、谷氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、丙氨酸常用的有甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、丙氨酸 以及酰胺类物质（如天门冬酰胺）以及酰胺类物质（如天门冬酰胺） 和多种氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白等）。和多种氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白等）。 用酶法等加工牛乳的水解产物，由于营养丰富，极易引起污染。用酶法等加工牛乳的水解产物，由于营养丰富，极易引起污染。 如在培养中无特别需要，以不用为宜。如在培养中无特别需要，以不用为宜。3）肌醇）肌醇 肌醇具有帮助活性物质（肌醇具有帮助活性物质（VB1）发挥作用的效果，能使培养物快速生长，）发挥作用的效果，能使培养物快速生长，对胚状体和芽的形成

15、有良好的促进作用。对胚状体和芽的形成有良好的促进作用。4）天然有机附加物）天然有机附加物大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。但对器官的分化作用不明显。它的成分大多不清楚，与其成熟度及产地关系也很大，它的成分大多不清楚，与其成熟度及产地关系也很大，所以一般应尽量避免使用。所以一般应尽量避免使用。 椰乳：是使用最多、效果最好的一种天然复合物。椰乳：是使用最多、效果最好的一种天然复合物。 它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。它在愈伤组织和细胞培

16、养中有促进作用。 在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用。在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用。香蕉：用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色，对香蕉：用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色，对pH值的缓冲作用大。值的缓冲作用大。 主要在兰花的组织培养中应用。主要在兰花的组织培养中应用。马铃薯：去掉皮和芽后，加水煮，再经过过滤，取其滤液使用。马铃薯：去掉皮和芽后，加水煮，再经过过滤，取其滤液使用。 对对pH值缓冲作用也大。值缓冲作用也大。酵母提取液：主要成分为氨基酸和维生素类。酵母提取液：主要成分为氨基酸和维生素类。其他，麦芽提取液、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未

17、熟玉米的胚乳等。其他，麦芽提取液、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。 遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。 3. 碳源碳源为细胞提供合成新化合物的碳骨架，为细胞提供合成新化合物的碳骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物与能源，为细胞的呼吸代谢提供底物与能源，还可以维持一定的渗透压。还可以维持一定的渗透压。最常用的碳源是蔗糖。最常用的碳源是蔗糖。葡萄糖和果糖也是较好的碳源，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。浓度：浓度：2%-4%，最常用，最常用

18、3% 。在大规模生产时，可用食用的白糖代替。在大规模生产时，可用食用的白糖代替。4. 植物生长调节剂植物生长调节剂1）生长素类）生长素类 诱导细胞脱分化，促进愈伤组织的形成；诱导细胞脱分化，促进愈伤组织的形成； 促进细胞伸长生长和细胞分裂；促进细胞伸长生长和细胞分裂； 促进生根。促进生根。吲哚乙酸：激素，有利于根形成，吲哚乙酸：激素，有利于根形成， 但是它容易被氧化和光解，组织培养中通常使用合成的生长素。但是它容易被氧化和光解，组织培养中通常使用合成的生长素。吲哚丁酸：诱导许多植物生根。吲哚丁酸：诱导许多植物生根。萘乙酸：最适宜诱导愈伤组织或诱导某些外植体生根。萘乙酸：最适宜诱导愈伤组织或诱导

19、某些外植体生根。二氯苯氧乙酸（二氯苯氧乙酸（2,4-D）：引起脱分化。）：引起脱分化。 能够引起染色体变异，因此使用时必须格外小心。能够引起染色体变异，因此使用时必须格外小心。作用效力作用效力吲哚乙酸（吲哚乙酸（IAA）吲哚丁酸（吲哚丁酸（IBA）萘乙酸萘乙酸（NAA）二氯苯氧乙酸（二氯苯氧乙酸（2,4-D）2）细胞分裂素类）细胞分裂素类 促进细胞分化；促进细胞分化； 有利于细胞分裂和愈伤组织的形成；有利于细胞分裂和愈伤组织的形成； 促进细胞分裂与扩大，可使茎增粗，而抑制茎的伸长；促进细胞分裂与扩大，可使茎增粗，而抑制茎的伸长； 诱导芽的分化，促进侧芽发生。诱导芽的分化，促进侧芽发生。激动素：

20、最主要的用途是诱导芽的形成。激动素：最主要的用途是诱导芽的形成。 玉米素：是一种天然激素，价格昂贵，其作用稍差于苄氨基嘌呤。玉米素：是一种天然激素，价格昂贵，其作用稍差于苄氨基嘌呤。6-苄氨基腺嘌呤（苄氨基腺嘌呤（6-BA）：具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点，）：具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点， 是组织培养最常用细胞分裂素类。是组织培养最常用细胞分裂素类。 主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生。主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生。作用效力作用效力玉米素玉米素ZT6-苄氨基腺嘌呤苄氨基腺嘌呤6-BA激动素激动素KT腺嘌呤腺嘌呤3）赤霉素）赤霉素 赤霉素有赤霉素有1

21、27种，种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同，培养基中添加的是培养基中添加的是GA3，主要用于促进幼苗茎的伸长生长，主要用于促进幼苗茎的伸长生长， 促进胚状体发育成小植株。促进胚状体发育成小植株。5. 培养材料的支持物培养材料的支持物 琼脂琼脂固体培养时琼脂是最好的固化剂。固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂的用量在琼脂的用量在0.8-1.0%之间之间 。凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外， 还与高压灭菌时的温度、时间和还与高压灭菌时的温度、时间和pH值等因素有关。值等因素有关。其它：玻璃纤维、滤纸

22、桥、海绵、卡拉胶等。其它：玻璃纤维、滤纸桥、海绵、卡拉胶等。6、其他成分、其他成分抗生素物质：有青霉素、链霉素、庆大霉素等抗生素物质：有青霉素、链霉素、庆大霉素等, 可防止菌类污染，减少培养中材料的损失。可防止菌类污染，减少培养中材料的损失。抗氧化剂：易褐化的材料。抗氧化剂：易褐化的材料。活性炭：活性炭： 茎尖初代培养，加入适量活性炭，可以吸附外植体产生的致死性褐化物；茎尖初代培养，加入适量活性炭，可以吸附外植体产生的致死性褐化物； 新梢增殖阶段，活性炭可明显促进新梢的形成和伸长；新梢增殖阶段，活性炭可明显促进新梢的形成和伸长； 活性炭在生根时有明显的促进作用。活性炭在生根时有明显的促进作用。

23、 7、pH值值喜光、耐旱、耐盐碱：喜光、耐旱、耐盐碱： pH值中性；值中性；喜湿、耐阴、喜酸：喜湿、耐阴、喜酸： pH值偏酸。值偏酸。 培养基灭菌后，培养基灭菌后， pH值一般下降。值一般下降。（四）培养基的选择（四）培养基的选择几种基本培养基的特点几种基本培养基的特点1）富集元素富集元素平衡培养基平衡培养基 - MS培养基（典型代表）培养基（典型代表） 无机盐无机盐浓度高，元素间的比例较适合；浓度高，元素间的比例较适合； 缓冲缓冲性能好，某些元素略有损失不会影响离子平衡；性能好，某些元素略有损失不会影响离子平衡； 营养丰富营养丰富，不需再加入水解蛋白等有机成分；，不需再加入水解蛋白等有机成分

24、； 微量元素微量元素种类较全，浓度较高；种类较全，浓度较高； 适合多种植物，适合多种植物，用途广泛用途广泛。 与与MS相类似的培养基，相类似的培养基， LS、BL、BM、ER培养基等。培养基等。2）硝酸钾含量较高的培养基）硝酸钾含量较高的培养基 硝酸钾的含量高，硝酸钾的含量高， 铵态氮的含量低，铵态氮的含量低， 含有较高的盐酸硫胺素（含有较高的盐酸硫胺素（VB1）。）。如，如，B5（水稻成熟胚愈伤组织分化时用其微量元素部分）（水稻成熟胚愈伤组织分化时用其微量元素部分）、 N6（禾谷类植物的花药和花粉培养禾谷类植物的花药和花粉培养 ）、 SH培养基。培养基。3）中等无机盐含量的培养基）中等无机盐

25、含量的培养基大量元素无机盐约为大量元素无机盐约为MS的一半；的一半；微量元索种类减少而含量增高；微量元索种类减少而含量增高；2. 培养基选择培养基选择 1）背景调查）背景调查对该供试植物对该供试植物分类地位、生理特性、繁殖、栽培条件及品种类型等分类地位、生理特性、繁殖、栽培条件及品种类型等有充分的了解。有充分的了解。应详细查阅前人对该植物的研究工作，应详细查阅前人对该植物的研究工作，总结分析前人工作的成功和不足之处，总结分析前人工作的成功和不足之处，从而在此基础上确定基本培养基类型。从而在此基础上确定基本培养基类型。2）选择原则）选择原则l同一物种的不同亚种、品种间的基本培养基类型基本相同；同

26、一物种的不同亚种、品种间的基本培养基类型基本相同；l同一植物的不同组织、器官的基本培养基类型基本相同；同一植物的不同组织、器官的基本培养基类型基本相同；l营养成分需求与田间栽培有相似性；营养成分需求与田间栽培有相似性；l无机盐浓度是基本培养基类型的重要因素，无机盐浓度是基本培养基类型的重要因素， 应该作为培养基选择的重要参数；应该作为培养基选择的重要参数；l有机成分主要是种类的变化，每种成分含量的变化不大；有机成分主要是种类的变化，每种成分含量的变化不大；l在确定基本培养基类型后，研究最适的蔗糖浓度。在确定基本培养基类型后，研究最适的蔗糖浓度。3）激素的选择原则）激素的选择原则生长素生长素 主

27、要功能是促进细胞分裂、诱导愈伤组织和生根等，主要功能是促进细胞分裂、诱导愈伤组织和生根等， 各种生长素的强度按以下排列而减弱：各种生长素的强度按以下排列而减弱： 2,4-D、NAA、IBA和和IAA。 与细胞分裂素互作促进茎的增殖。与细胞分裂素互作促进茎的增殖。细胞分裂素细胞分裂素 主要促进细胞分裂，改变顶端优势，促进芽的分化等。主要促进细胞分裂，改变顶端优势，促进芽的分化等。 常用几种细胞分裂素的强度按以下排列减弱；常用几种细胞分裂素的强度按以下排列减弱； ZT、6-BA、KT和腺嘌呤。和腺嘌呤。激素选择原则激素选择原则细胞分裂素与生长素的比例是激素使用的关键；细胞分裂素与生长素的比例是激素

28、使用的关键；细胞分裂素与生长素的种类对不同植物的敏感性不同；细胞分裂素与生长素的种类对不同植物的敏感性不同；同一植物的不同组织在愈伤组织诱导和芽分化过程中对激素的要求不同。同一植物的不同组织在愈伤组织诱导和芽分化过程中对激素的要求不同。4 4）总结）总结基本培养基基本培养基 生长调节物质生长调节物质 糖糖 营养元素营养元素 天然附加物天然附加物 凝固剂凝固剂4）常用试验方法）常用试验方法单因子试验单因子试验 培养基中其他成分都不变，只变动一个因子。培养基中其他成分都不变，只变动一个因子。 就可以找出这一因子对试验的影响和影响的程度。就可以找出这一因子对试验的影响和影响的程度。多因子试验多因子试

29、验 对培养基中两个或两个以上因素进行研究。对培养基中两个或两个以上因素进行研究。 试验可采用完全试验方案、正交设计方案。试验可采用完全试验方案、正交设计方案。培养基配方培养基配方试验试验（五）培养基的配制（五）培养基的配制1. 对药品和水的要求对药品和水的要求 选择等级较高的药品选择等级较高的药品; 同一试验要用同一批次的药品同一试验要用同一批次的药品; 原则上用纯水。原则上用纯水。药品纯度等级药品纯度等级1、工作基准试剂（无简写标记，用汉语注明，绿色标签）：、工作基准试剂（无简写标记，用汉语注明，绿色标签）： 作为基准物质，标定标准溶液。作为基准物质，标定标准溶液。 2、优级纯（、优级纯（G

30、R，绿色标签）：用于精确分析和研究工作，有的可作为基准物质。，绿色标签）：用于精确分析和研究工作，有的可作为基准物质。 3、分析纯（、分析纯（AR，红色标签）：用于工业分析及化学实验，用得最多的等级。，红色标签）：用于工业分析及化学实验，用得最多的等级。 4、化学纯（、化学纯（CP，蓝色标签）：用于化学实验和合成制备。，蓝色标签）：用于化学实验和合成制备。 5、实验试剂（、实验试剂（LR ，黄色标签）：用于一般化学实验和合成制备。，黄色标签）：用于一般化学实验和合成制备。 2. 母液配制母液配制1）优点）优点 减少工作量减少工作量; 减少多次称量造成的误差减少多次称量造成的误差; 便于微量元素

31、的称量便于微量元素的称量; 保证每一个材料的培养基有相同的成分。保证每一个材料的培养基有相同的成分。2）母液种类）母液种类 大量元素：大量元素：1050倍；倍； 微量元素：微量元素：100200倍；倍； Fe盐：盐： 100200倍（棕色瓶）；倍（棕色瓶）； 有机物：有机物： 20100倍；倍； 植物生长调节剂母液植物生长调节剂母液 （1mg/ml）。）。3）母液配制注意事项）母液配制注意事项l植物生长调节剂的溶解植物生长调节剂的溶解 生长素类：碱溶；生长素类：碱溶； 95%乙醇溶、蒸馏水定容。乙醇溶、蒸馏水定容。 细胞分裂素类：酸溶、蒸馏水定容。细胞分裂素类：酸溶、蒸馏水定容。 赤霉酸：热水

32、溶，以赤霉酸：热水溶，以95%乙醇配成原液。乙醇配成原液。Fe盐制备：将两物质分别溶解在盐制备：将两物质分别溶解在450ml水中，水中， 然后混合，然后混合， 定容。定容。配制好的母液分别贴上标签配制好的母液分别贴上标签MS MS 大量元素大量元素10 X 10 X 查仁明查仁明 04.04.0404.04.04贮存：温度贮存：温度2-4度，度， 一般无机物一般无机物3-6个月，个月， 有机物有机物3个月。个月。3、培养基配制、培养基配制 蒸馏水蒸馏水母液母液生长调节剂生长调节剂琼脂粉琼脂粉蔗糖蔗糖 融化融化调节调节pHpH分装分装灭菌灭菌冷却冷却二、无菌技术二、无菌技术有菌的范畴有菌的范畴凡

33、是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。至少它的表面都是有菌的，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。无菌的范畴无菌的范畴经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体，经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体，高层大气、岩石内部、高层大气、岩石内部、强酸强碱，化学元素灭菌剂等的表面和内部等等都是无菌的。强酸强碱，化学元素灭菌剂等的表面和内部等等都是无菌的。 污染污染 指在组织培养过程中由于真菌、细菌或病毒的侵染，

34、指在组织培养过程中由于真菌、细菌或病毒的侵染，而使培养基和培养材料滋生杂菌，而使培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。导致培养失败的现象。直接侵入培养物中，杀死培养物；直接侵入培养物中，杀死培养物；向培养基分泌有毒物质，毒死培养物；向培养基分泌有毒物质，毒死培养物；竞争培养基养分使营养耗尽，培养物饥饿而死。竞争培养基养分使营养耗尽，培养物饥饿而死。污染所引起的危害污染所引起的危害污染引起的危害有的是极明显的，污染引起的危害有的是极明显的，如早期培养的失败，增殖效率的降低，生长减慢，玻璃苗增加，生长的不均匀等；如早期培养的失败，增殖效率的降低，生长减慢，玻璃苗增加，生长的不均匀等；而有的

35、影响可在以后的过程显现，如移栽困难和苗的死亡，田间的不良表现。而有的影响可在以后的过程显现，如移栽困难和苗的死亡，田间的不良表现。污染也会引起培养物的遗传变异。污染也会引起培养物的遗传变异。有些病原菌的存在（如国际上已发现的某些商业生产的试管苗有些病原菌的存在（如国际上已发现的某些商业生产的试管苗带有胡萝卜软腐欧文氏菌），可以引起多种作物的病害；带有胡萝卜软腐欧文氏菌），可以引起多种作物的病害；试管苗（在未进行专门的病原体脱除和鉴定时）试管苗（在未进行专门的病原体脱除和鉴定时）也常是很多致病的病毒、类病毒、类菌原体的携带者，也常是很多致病的病毒、类病毒、类菌原体的携带者，育目发展可能引起病毒大

36、规模的扩散。育目发展可能引起病毒大规模的扩散。（一）污染源及其表现特征（一）污染源及其表现特征1. 外植体外植体 表面带菌：接种后很快长出微生物菌落表面带菌：接种后很快长出微生物菌落; 内生带菌：接种后一定时间才表现出来。内生带菌：接种后一定时间才表现出来。 特征：靠近外植体培养基表面出现微生物菌落。特征：靠近外植体培养基表面出现微生物菌落。 2. 培养基培养基 在培养基表层和深层同时出现点状分布的菌落。在培养基表层和深层同时出现点状分布的菌落。3. 培养器皿培养器皿 在培养基与容器接触处在培养基与容器接触处 或器壁上出现菌落。或器壁上出现菌落。4. 工作人员工作人员 在培养基表面在培养基表面

37、 或操作器械接触处出现菌落。或操作器械接触处出现菌落。5. 空气空气 原因：超净工作台故障；原因：超净工作台故障； 瓶塞过松瓶塞过松 特征：在培养基表面靠近培养容器壁处出现菌落。特征：在培养基表面靠近培养容器壁处出现菌落。（二）常用的灭菌方法（二）常用的灭菌方法灭菌灭菌用物理或化学的方法，用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。即把所有生命的物质全部杀死。消毒消毒杀死、消除或充分抑制部分微生物，杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。使之不再发生危害作用。1. 加热灭菌加热灭菌1）湿热灭菌

38、）湿热灭菌设备：高压灭菌锅设备：高压灭菌锅原理：通过蒸汽接触材料表面原理：通过蒸汽接触材料表面 冷凝时释放热能达到杀死微生物的目的。冷凝时释放热能达到杀死微生物的目的。工作条件：工作条件：1-1.2kg/2，20-30 min。 121 ，15 min。 注意事项注意事项 灭菌前排尽冷空气；灭菌前排尽冷空气； 灭菌后压力切勿降低太快。灭菌后压力切勿降低太快。2 2）干热灭菌）干热灭菌灼烧灼烧 蘸蘸95%酒精燃烧器具。酒精燃烧器具。烘烧烘烧 设备：设备： 烘箱烘箱 工作条件：工作条件：140，4h 或或160-170，2-3h注意事项：注意事项： 要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染；要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染； 温度一般勿超过温度一般勿超过175 2. 化学灭菌化学灭菌 1）液体灭菌：酒精、升汞、双氧水、次氯酸钠等，适用于外植体表面灭菌。）液体灭菌：酒精、升汞、双氧水、次氯酸钠等，适用于外植体表面灭菌。 2）气体灭菌：甲醛、乙二醇。）气体灭菌：甲醛、乙二醇。 向甲醛内加入高锰酸钾，促进甲醛的快速挥发而起到灭菌的作用。向甲醛内加