牛血液中SOD的提取分离纯化及鉴定

1、中央民族大学生命与环境科学学院生物化学实验综合性设计实验报告牛血中SOD分离纯化及含量、活性、相对分子质量的测定The separation, collection, purification and identification of SOD from the cow blood姓 名：唐胜华 学 号： 0941063 年 级： 09生科 专 业： 生物科学 小组成员： 韩旭思 关晴月 指导教师： 刘立亚 2011年12月17日牛血中SOD分离纯化及含量、活性、相对分子质量的测定 唐胜华 韩旭思 关晴月 （中央民族大学 北京市 100081）摘要：目的 熟练掌握从动物血液中提取SOD及分离鉴

2、定和活力测定。方法 破碎细胞释放其中的内涵物，有机溶剂去除血红蛋白，再用透析法纯化所得SOD，然后根据SOD的物理化学性质进行各项指标测定。结果 实验中SOD在限制邻苯三酚自氧化的用量时随着提取纯化次数的增加而增加，PAGE电泳胶块染色和脱色后可以明显的发现胶块正中央有透明区域。结论 动物血液中含有，它具有抑制氧化作用的功能。关键词：SOD，邻苯三酚自氧化，电泳，抑制氧化。Theseparation,collection, purification and identification of SOD from the cow blood TANG Sheng-hua， HAN Xu-si, G

3、UAN Qing-yue (MinZu University of China, City of Beijing,100081)Abstract: Objective From the experiment, we can know exactly how to get SOD from cow blood, then separate, collect, purify and identify it. Methods we start on determining the feature of SOD after extracting, separating, and collecting

4、it, then we will get what we want from the experiment. Results through the experiment, obviously that the amount of Pyrogallol used to suppress the Oxidation rate is increased with the steps to separate, collect, purify the SOD increasing. Also we can find that there is a Transparency in the middle

5、of the Rubber block after the Electrophoresis finished. Conclusions Through the experiment, we deeply know that there is always some SOD in the animal blood which itself can suppress the Oxidation rate in the body.Keywords:SOD, self-Oxidation of Pyrogallol, PAGE Electrophoresis, Oxidation-supression

6、前言近年来，随着生物科学领域中分子生物学的迅速发展，使得之前只能从细胞层面研究血液组成及功能的瓶颈得以突破，进入研究血红细胞中分子组成的层次。由此，在大量实验中都存在着这么一种现象，红细胞中有某种组成成分能够抑制生物自氧化的速率，延缓细胞衰老和凋亡的时间。通过大量的实验证明，这种物质就是超氧化物歧化酶（又称SOD），是一种能专一地清除超氧阴离子自由基(O2)的金属酶。按所含金属离子不同可分为CuZnSOD、MnSOD 和FeSOD。SOD催化反应：2H+2O22H2O2+O2。SOD对过量的O2的及时清除保证了机体内O2的含量相对平衡，对机体起防护作用。国内外研究表明SOD具有抗炎、抗衰老抗辐

7、射等重要作用。我国近年来在植物SOD的研究领域有大量相关进展报道。许平、袁艺、赵文芝、余旭亚等分别从大蒜、桑叶、沙棘、仙人掌中提取出SOD并进行相关研究。其提取方法因原材料的不同而不同，本实验通过对牛血红细胞中SOD的研究，证明SOD的生理作用以及影响其活性的因素，从而从更深层面上认知SOD的生理生化作用。1.材料和方法1.1实验材料与试剂新鲜牛血液（含有柠檬酸钠抗凝剂）1.1.1实验试剂0.6%的TritonX-100溶液，0.9%的生理盐水，4下预冷的95%乙醇，4下预冷的氯仿，丙酮，蒸馏水，2.5mmol/LpH7.6磷酸钾缓冲液，0.05mol/L邻苯三酚，10mmol/L的HCl溶液

8、，考马斯亮蓝R-250试剂，100mg/mL的标准蛋白溶液。电泳试剂PAGE电泳试剂：2.45*10-3mol/L NBT溶液，3.60*10-2mol/LpH7.8的磷酸缓冲液，5*10-2 mol/LpH7.8的磷酸钠缓冲液，40%蔗糖，0.14%过硫酸铵(AP)，20%的乙醇，7%的冰乙酸的水溶液，0.5mol/LNaCl水溶液，0.25%的考马斯亮蓝R-250染色液，含有50%乙醇和10%的冰乙酸的水溶液，浓缩胶缓冲液，分离胶缓冲液，样品溶解液，1*电极缓冲液，10%的（m/V）SDS贮液。实验仪器10mL、25mL量筒各两个，烧杯，10mL的小试管10支，玻璃棒，冰箱，恒温水浴箱，1

9、0000道尔顿的透析袋，离心机（10、50mL的离心管），移液枪（10uL、50uL、200uL、1000uL）和对应枪头各一套，25mL、50mL、100mL容量瓶各一个，721分管光度计一台，垂直板电泳槽。1.2实验方法牛血液中SOD的提取与分离纯化沉淀红血球：取配好的牛血液200mL(7份血液：1份柠檬酸三钠)，装入4个50mL的离心管中，,以4000r/min离心处理10min，吸除上清液( 血浆)，收集下层红血球沉淀约100mL。低渗涨破细胞：把收集的血球加等体积0.9%的氯化钠溶液, 以4000r/min离心处理10min,重复3 次,得洗涤红血球。然后在洗净的红血球中加入等体积0

10、.6%的tritonX-100溶液，在40C条件下,搅拌溶血30min,在040C下放置30min以上,使红血球充分破裂。沉淀血红蛋白：按溶血体积的0.25倍缓慢加入预冷至40C的95%乙醇, 再按溶血体积的0. 15倍加入预冷至40C的氯仿, 搅拌15min,静置30min,4000r/min离心处理10min,收集上清液,弃去沉淀物（留样3.0mL测酶活，蛋白质浓度及电泳鉴定）。SOD的再提纯：在上清液中加入K2HPO4.3H2O(43gK2HPO4.3H2O：100mL上清液)，充分搅拌，转移至分液漏斗，振摇后静置15min，室温下4000r/min离心10min，见明显的分层，收集含有

11、SOD的上层乙醇-氯仿相（微显浑浊），室温下4000r/min离心20min，弃去沉淀，收集上清液约60mL（留样3.0mL测酶活，蛋白质浓度及电泳鉴定）。沉淀SOD：像上一步得到的上清液中加入0.75倍体积40C预冷过的丙酮，出现SOD沉淀，室温下4000r/min离心20min收集灰白色的沉淀物。溶解沉淀：把沉淀物用2 倍蒸馏水溶解,在65 0C的水浴中保温15min,迅速冷却至室温,4000r/min离心10min收集上清液,弃去沉淀物（留样1.5mL进行酶活和蛋白质浓度测定及电泳鉴定）。透析纯化：将剩下的溶解液，装入截留量为10000道尔顿的透析袋中，40C条件下于200mL浓度为2.

12、5mmol/L pH值为7.6的磷酸缓冲液中透析，每隔0.5h换透析液一次，总共进行4次，若有沉淀，则4000r/min离心30min，弃去沉淀物，收集上清液（留样0.5mL测定酶活，蛋白质浓度及电泳鉴定）。邻苯三酚法测定SOD活性，用分光光度计在波长为325nm下测其OD值邻苯三酚的自氧化率测定：取两支试管按下表1加入缓冲液（50mmol/LpH为8.2的Tris-HCl），于25oC保温20min，然后加入25oC预热过的邻苯三酚液，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325nm波长下测定A值，于恒温池中每隔30s侧吸光值一次。计算线性范围内每1min吸光的增值，此即为邻苯三酚的自氧化速

13、率，要求自氧化速率控制在正好0.070 A/min左右。注意，空白对照用10mmol/L的盐酸代替邻苯三酚。 表1.邻苯三酚自氧化速率测定加样表 Table 1 The table of how to add the Sample 试剂 空白管 自氧化管pH8.2的Tris-HCl缓冲液（mL） 4.5 4.510mmol/L的HCl（uL） 170 45mmol/L的邻苯三酚（uL） 170酶活性测定：按照下表2要求加样，测定操作同邻苯三酚自氧化速率相同，根据酶活性情况可以适当调整样品液加入量。 表2.酶活性测定加样表 Table 2 The table for how to add Enz

14、yme 试剂 对照管 实验管pH8.2的Tris-HCl缓冲液（mL） 4.5 4.5 酶溶液（uL） - 4045mmol/L的邻苯三酚（uL） - 170 10mmol/L的HCl（uL） 170 -酶活力计算：在规定条件下，1mL反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为一个酶活力单位，计算公式如下： SOD活力（U/mL）=(0.070- A325)/0.070*100%*V总*稀释倍数 50%*V样V总反应总体积；V样加入样品液的体积。 总活力（U）=单位体积活力*原液总体积考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度绘制标准曲线：取六支试管编号，按照下表3要求加入试剂，盖上盖子摇匀

15、，注意各管震荡程度尽量一致。放置10min。在595nm波长下比色测定光吸收值，比色应在1h内完成。以牛血清蛋白含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制曲线。 表3.标准蛋白曲线测定加样表 Table 3 The table of how to add the sample when getting the Curve of standard protein 试剂 1 2 3 4 5 6蛋白质标准液/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.9%的NaCl溶液/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0考马斯亮蓝G-250/mL 5 5 5 5 5 5蛋白质含量/ug 0 20 40

16、 60 80 100样品中蛋白浓度的测定：样品中蛋白浓度的测定。将待测的SOD溶解并稀释至一定的浓度，取1支试管，准确加入0.1 ml样品提取液，加入0.9 ml蒸馏水和5 ml考马斯亮蓝R- 250试剂，其余操作与标准曲线制作相同。注意，也可以直接取用提取液，不进行稀释操作。结果计算：根据所测样品提取液的光吸收值，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（ug）；样品（SOD）蛋白质含量=查到的蛋白质浓度（mg/mL）*提取液的体积(mL)/样品质量(g)*测定时提取液的体积(mL) 酶比活力的测定=样品液中酶总活力/样液中蛋白质的含量 SDS-PAGE不连续电泳测定SOD的相对分子质量上样：安装垂

17、直板电泳槽，用1%的琼脂糖封底，配制浓缩胶和分离胶，上样电泳，上样时取各步样液加入等体积的40%的蔗糖（含有少量的溴酚蓝）。每孔加入上述各步提取的SOD初提液及最终提取液15uL,以对称方式加样。电泳：连接电源，上槽接负极，下槽接正极，接通冷却水及电源开关，调节电流至15mA,待样品由浓缩胶进入分离胶时，再将电流调节至2030mA，当染料前沿距离硅橡胶框下缘12cm时，关闭电源，电泳结束，取出胶块，一分为二。染色和脱色：用0.05%考马斯亮蓝R-250（内含20%的磺基水杨酸）染色液染色，染色与固定同时进行，使染色液没过胶版，染色30min左右。脱色时用脱色液浸泡数次，直至背景色退去。1.2.

18、4 PAGE电泳鉴定SOD配胶方法同1.2.3所述，唯一的差别就是此处不加入SDS，其他操作也同SDS-PAGE。当电泳结束后，将胶块取出，进行活性染色观察。2.结果2.1邻苯三酚自氧化法测SOD酶活2.1.1邻苯三酚自氧化速率测定数据如下表4所示，为使得邻苯三酚的自氧化速率在0.070/min左右变化，通过改变邻苯三酚的用量来调整其自氧化速率，随着邻苯三酚加入量的增加，其自氧化速率增值也变快。 表4.邻苯三酚自氧化速率数据 Table 4 The date of Pyrogallols self-Oxidation-rate 时间/s 0 30 60 90 120 150 1801 0.15

19、1 0.187 0.220 0.254 0.290 0.326 0.3612 0.233 0.268 0.303 0.338 0.373 0.408 0.4433 0.121 0.154 0.222 0.254 0.286 0.328 0.348平均值 0.168 0.203 0.248 0.282 0.316 0.354 0.384在测定自氧化速率时，所用的的邻苯三酚用量为170uL，自氧化速率为0.072/min。四种各步提取液的活性测定数据初提液1的 活性测定结果如下表5所示，在用超氧化物歧化酶抑制邻苯三酚自氧化时，其抑制作用与SOD的加入量成正比，为使得最终变化率在0.035/min左

20、右，适当的增加或者减少酶液用量来达到此目的。 表5.提取液1的活性测定结果 Table 5 The result of the Vitality determined of the first steps extract 时间/s 0 30 60 90 120 150 180 1 0.036 0.053 0.067 0.080 0.094 0.109 0.1242 0.042 0.056 0.071 0.086 0.101 0.116 0.1313 0.034 0.049 0.064 0.078 0.094 0.105 0.121平均值 0.0373 0.0527 0.0673 0.0813

21、0.0963 0.1067 0.1220以上用SOD抑制邻苯三酚自氧化时，所用的酶提取液用量为40uL，邻苯三酚的自氧化速率为0.028/min，最后的总体积为4.5mL。单位酶活（U/mL）=(0.070-0.028)/0.070*100%*4.5mL*2/0.040mL=137.5U/mL 总酶活力（U）= 137.5U/mL*66mL=9065.76U 初提液2的活性测定结果如下表6所示，在测定酶液2的活性时，同样也是通过改变酶提取液2的用量来控制其抑制作用的强弱。 表6.提取液2的活性测定结果 Table 6 The result of the Vitality determined

22、of the second steps extract 时间/s 0 30 60 90 120 150 1801 0.105 0.125 0.144 0.164 0.183 0.198 0.2162 0.111 0.126 0.142 0.158 0.174 0.187 0.2033 0.101 0.119 0.134 0.149 0.166 0.182 0.198平均值 0.106 0.123 0.140 0.157 0.174 0.189 0.206以上以上用SOD抑制邻苯三酚自氧化时，所用的酶提取液用量为30uL，邻苯三酚的自氧化速率为0.033/min，最后的总体积为4.5mL。单位酶

23、活（U/mL）=(0.070-0.033)/0.070*100%*4.5mL*2/0.030mL=158.57U/mL 总酶活力（）158.57U/mL*27mL=4599.99U初提液3的活性测定结果在测定初提液3的活性时，经过多次反复测定和调整初提液3的用量，仍然无法达到预期的效果，即无法抑制邻苯三酚的自氧化率在0.035/min左右。最终，由于留置的初酶提取液有限，故此处不再要求其速率必须在固定的范围内。 表7.提取液3的活性测定 Table 6 The result of the Vitality determined of the third steps extract时间/s 0

24、30 60 90 120 150 180 1 0.036 0.069 0.103 0.135 0.163 0.193 0.2232 0.030 0.064 0.097 0.128 0.156 0.186 0.2163 0.046 0.079 0.113 0.145 0.173 0.203 0.233平均值 0.037 0.070 0.104 0.129 0.157 0.187 0.217以上以上用SOD抑制邻苯三酚自氧化时，所用的酶提取液用量为100uL，邻苯三酚的自氧化速率为0.060/min，最后的总体积为4.5mL。单位酶活（U/mL）=(0.070-0.060)/0.070*100%*

25、4.5mL*2/0.1mL=2.714U/mL 总酶活力（）2.714U/mL*6.6mL=17.914U2.1.2.4最终提取液的活性测定结果本次实验中，因为实验中途Tris-HCl更换，导致前后邻苯三酚在自氧化速率达要求值时（0.070/min）用量不一致，重新得出的邻苯三酚自氧化速率为0.070/min时的用量为110uL。本组在实验中测定最终提取液的酶活时，发现SOD已经完全失去活力，无论加入多少的最终提取液，邻苯三酚的自氧化速率不受影响。2.2蛋白质浓度的测定标准蛋白曲线的制定标准蛋白经考马斯亮蓝染色后，测定其595nm波长下吸光值，结果如下表7所示： 表7 标准蛋白吸光值 Tabl

26、e 7 The absorption value of standard protein标准蛋白浓度mg/mL 0 10 30 50 70 901 0 0.101 0.277 0.325 0.485 0.5742 0 0.102 0.281 0.326 0.487 0.5733 0 0.108 0.282 0.327 0.489 0.574平均值 0 0.104 0.280 0.326 0.487 0.574根据上表数据，以吸光度为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标，得到标准蛋白曲线。 图1.标准蛋白曲线各步提取液的蛋白浓度测定实验中，对于各步SOD提取液，测得的OD值结果如下表8所示。 表8.各步

27、酶初提液的蛋白质吸光值 Table 8 aThe bsorption value of each steps primary extract 酶提取液 初酶液1 初酶液2 初酶液3 初酶液41 0.112 0.284 0.102 0.0342 0.112 0.287 0.106 0.0443 0.113 0.284 0.104 0.045平均值 0.112 0.285 0.104 0.041将表中的提取液OD值的平均值带入标准曲线，计算求得各提取液中的蛋白质浓度为：C提取液1（mg/mL）=（）/(6.065*0.1)=0.122mg/mLC提取液2（mg/mL）=（）/（6.065*0.1）

28、=0.407mg/mLC提取液3（mg/mL）=（）/（6.065*0.1）=0.109mg/mLC提取液4（mg/mL）=(0.041-0.038)/（6.065*0.1）=0.005mg/mL由提取液的浓度，可以计算求得各步提取液中所含有的蛋白质含量为： M提取液1=0.122ug.mL*66mL=8.052mg M提取液2=0.407mg/mL*27mL=10.989mg M提取液3=0.109mg/mL*6.6mL=0.7192mg M提取液4=0.005mg/mL*10.6mL=0.053mg综上所述，蛋白质的浓度和含量结果如下表9： 表9.酶提取液中蛋白质浓度与含量 Table 9

29、 Density and content of the protein 酶提取液 初酶液1 初酶液2 初酶液3 初酶液4蛋白质浓度/mg/mL 0.122 0.407 0.109 0.005蛋白质含量mg 8.052 10.989 0.719 0.0532.2.3 酶比活力测定结果根据上面计算得到的总酶活力和蛋白质的含量，可以计算出酶的比活力，计算过程如下： Y（提取液1的酶比活力）=9065.76U/8.052mg=1123.902U/mg Y（提取液2的酶比活力）=4599.99U/10.989mg=418.600U/mg Y（提取液3的酶比活力）=17.914U/0.719mg=24.9

30、15U/mg最终提取液因用邻苯三酚自氧化法测得的酶活力为0，故此处得到的结果Y=0。 2.3 SOD的相对分子质量测定和电泳鉴定2.3.1 SDS- PAGE测定SOD相对分子质量质量电泳结束后，取下胶块经过考马斯亮蓝染色和脱色后，所得到的结果可以发现，因为蛋白质的浓度比较小，上样液中的蛋白质含量也较少，故染色后着色较浅。Mark因上样量少着色也很浅，所以无法准确确定SOD以及其他杂质蛋白质的相对分子质量，故所以本实验的SOD相对分子质量只能在某一个范围内。 图2.SDS-PAGE电泳测蛋白质相对分子质量结果 Feature 2 The result of electrophoresis to

31、 determined relative molecular mass由于染色着色不明显，所以SOD的估计相对分子质量范围为31000-33000之间。 PAGE电泳鉴定SOD电泳结束后，经过活性染色，发现胶块的中央部分有明显的透明区，结果如图所示。 图3. 活性染色鉴定SOD的结果 Feature 3 The result of identifying SOD 活性染色后，SOD能抑制活性染料NBT光化还原而显无色，形成图片中的透明区，其他部位因无此作用而显色，比较之下就验证了超氧化物歧化酶的存在。3.讨论3.1邻苯三酚法测定酶活力通过比较发现，酶的总活力随着提取步骤的增加而呈现下降的趋势，

32、提取液3和提取液4几乎没有酶活。而酶的相对酶活力（比活力）却与正确结果相反，正确的结果是随着提纯浓缩，酶的比活力会随着浓缩操作的推进而变大。其中，酶的总活力反应了酶的含量，而酶的比活力反应了酶的纯度，可见我们组的酶纯度是随着提取操作的推进而下降的，酶失活是造成此种情况的主要因素。我们组在本次实验中，酶的比活力却是随着提取操作的推进而变小，造成这种酶失活现象出现的原因是多方面的。 图4.酶比活力走势图 Feature 4 The enzyme specific activity chart首先，在进行多步提取操作中，都使用了离心沉淀这一纯化方法。离心时，随着离心次数的增加，由于本组采用的是常温离

33、心法，离心温度会随着离心机温度的变化而变化，在4000r/min离心20min的过程中，有大部分的酶会变性失活。其次，是在用有机溶剂纯化时没起到理想的纯化结果。如丙酮沉淀纯化，根据原理，丙酮沉淀法是利用向蛋白质溶液中加入弱极性的有机溶剂，改变溶液的介电常数，使不同种类蛋白质的溶解度产生不同程度降低的原理使蛋白质纯化。然而不同的丙酮加入量与搅拌时间会影响SOD 的纯化结果，本组使用的条件是加1倍体积、预冷的丙酮，4000r/min离心20min，根据实验结果，我们可得出结论在1倍体积、预冷的丙酮，4000r/min离心20min的条件下达不到分离纯化SOD的效果，反而阻碍了SOD的分离纯化。还有

34、，就是在使用650C热变性沉淀杂质蛋白的时候，也沉淀了许多的目标蛋白SOD。再次，就是本次试验所使用的邻苯三酚也存在问题，相同浓度，在正常情况下只需40uL左右就可以使得自氧化速率达到0.070/min,而我们这次实验用了170uL才达到了相同的效果，所以使用这种丙酮测定的SOD活力也是不科学的。最后，也与操作的不当和仪器的差异而使得结果出现严重的偏差。综上所述，本次试验测得的酶比活力未达到预期效果，主要原因是在纯化SOD的过程中是酶变性失活率高过了纯化浓缩率，使酶比活随着提取次数增加而降低。3.2各步提取液中蛋白质浓度及含量的测定理论上，随着分离纯化的延续，蛋白质的含量会呈下降趋势，在这过程

35、中有部分的非目标蛋白质会被分离出去。从蛋白质含量走势图中，明显可以看出，我们组在实验中，所得到的结果与理想蛋白质含量走势图有差异，本组的初酶提取液2中所含有的蛋白质量比酶提取液1还要多，这可能是测量初酶提取液1时出错导致总酶含量的计算值小于其真实值，同样，也可能是在测量酶2时读得的吸光值比实际的吸光值大而使得初酶提取液2中蛋白质的计算含量高于其实际含量，这可能与。分光光度计本身的差异有关，又或者使用的比色皿不配对，以至于测得的结果有较大的差异。 图5.各步提取液中蛋白质含量 Feature 5 The quantity of the protein from each step至于为什么理论蛋

36、白质含量会呈下降趋势，主要因素是在提取过程中，用有机溶剂处理和650处理，使蛋白质变性沉淀或者改变溶液的电介导系数，使得蛋白质逐步减少。通过实验发现，为了得到纯度更高的SOD，可以在适当增加所用的丙酮的用量和处理时间，还有就是降低操作的温度，这有助于提高SOD的纯度和酶比活力。3.3 SDS-PAGE电泳测SOD的相对分子质量本次实验，上样采取对称上样的方法，顺序为Mark、酶初提液1、酶初提液2、酶初提液3、酶初提液4、酶初提液4、酶初提液3、酶初提液2、酶初提液1，每孔上样量为15uL，除了酶初提液4以外，其他各孔所含有的蛋白质质量均在10ug以上，但没超过20ug。电泳中，发现蛋白质移动

37、的速度极其缓慢，为了节省电泳时间，本组将电流120mA。发现，蛋白质的移动速度明显变快，没多久就接近前沿部位。电泳结束后，经过考马斯亮蓝染色和乙酸脱色后，如图2所示，并没有明显的蛋白质残留痕迹，Mark也不明显，影像模糊难以准确辨认。这种现象出现的主要原因是上样液中蛋白质含量低所致，为了得到更为明显的电泳结果，应该适当的增加上样量来增加蛋白质的含量，以此弥补酶提取液中蛋白质浓度低的缺陷，使实验结果明显可辨。其次，就可能与染料和染色时间有关，我们组染色时只染了30min,可能时间过短，有大部分蛋白质还来不及着色或者着色还不稳定，在后面的洗脱时使得部分与蛋白质结合的染料液洗脱下来，使得染色最终结果

38、不明显。最后，从图2中已经难以读出SOD的相对分子质量，而实际上实验当天的胶块还是能模糊辨认出Mark与各步提取液的着色部位的，只是不清晰，查表估算得到SOD的值大概为31000-33000之间。 3.4 PAGE电泳鉴定SOD该电泳与SDS-PAGE电泳的唯一区别就是PAGE电泳制胶时不加入SDS这种掩盖蛋白质原来电荷的试剂，SDS可以改变蛋白质的带电状态而使其变性失去活力。而这里鉴定SOD是利用SOD的酶活性为根据的，所以加入SDS会使SOD因失活而不能起抑制氧化的作用，亦即不能够抑制NBT的光化还原，最终活性染色的不到实验室预期结果。从实验结果中可以看出，本组实验还是比较成功的，胶块的中

39、央有明显的透明区域，而非透明区是因为NBT光化还原产生有色的物质所致，活性染色剂中，核黄素经光照所产生的活性氧O2-（氧自由基）能使氯化硝基四氮挫蓝（NBT）由黄色的氧化型转化为蓝色的还原型，SOD能够抑制O2-的作用，因此，电泳分离SOD后凝胶上无SOD处应显示为蓝色，而有SOD处则无色透明。中间的透明区覆盖了上样槽对应的所有区域，证明了各步提取液均含有一定量的SOD。由此可以看出，在用邻苯三酚法检测时没有活力的酶最终提取液4和仅含有微量酶活的提取液3，在此处均有较强的活力。这说明了用邻苯三酚法测定SOD的酶活力并不科学，不能够准确确认SOD是否含有活力或者活力的大小，这是本实验应该改进之处

40、。综上所述，在PAGE电泳和SDS-PAGE电泳中，应该注意以下几点：a、在制备胶块时，尽量拌匀凝胶缓冲液，使其凝结时各处密度保持均一，避免电泳时蛋白质条带发生歪斜。b、在注胶前，应该检查封底的胶条是否水平呈一直线，这和胶上表面是否平直密切相关，也和样品电泳起跑线有关。C、上样时，应该要熟练规范，准确地将样品加入到样品槽中，枪移出时注意别将样品液带出而漂浮于电解液中，影响电泳效果。4.0 结论4.1 SOD活力测定及蛋白质含量测定通过实验，结合理论知识发现，SOD可以抑制邻苯三酚的自氧化速率，抑制效果随着SOD的纯化更加明显。在对SOD的分离纯化中，采用先进的分离纯化方法，可以有效的降低SOD

41、酶的失活率，从而提高酶的比活力。在蛋白质浓度及含量的测定中，经考马斯亮蓝结合后，蛋白质可以强烈吸收595nm处的波，通过测量其吸光度可以准确的计算出蛋白质的浓度和含量。本组在对SOD进行提纯操作时，操作本身对SOD的破坏速率超过纯化的速率，致使酶的比活力随着提取纯化操作的推进而减小。4.2 SDS-PAGE电泳测蛋白质相对分子质量和PAGE法电泳鉴定SOD通过SDS-PAGE电泳，我们测得的SOD值在31000-33000之间。通过PAGE电泳和活性染色，我们确定了各步提取液中均含有一定量的SOD。致谢 衷心感谢中央民族大学生命与环境科学学院为我们提供实验实验场地和实验器材，刘立亚老师对我们大组的悉心指导和后援支持，也感谢本组全部组员的积极配合和默默无闻的奉献精神。 参考文献1余瑞元,袁明秀，陈丽蓉,等.生物化学实验原理和方法M.北京：北京大学出版社，2011,2:345-3532 杜秀敏,殷文璇,张慧,等.超氧化物歧化酶( SOD )的研究进展.中国生物工程杂志,2003,23( 1):48-50.3