荧光定量PCR技术临床应用

1、荧光定量荧光定量PCRPCR技术在临床技术在临床医学研究中的应用及注意事项医学研究中的应用及注意事项内内 容容 提提 要要一、基因诊断技术在医学检验中的地位二、荧光探针定量PCR在临床医学中的应用三、荧光探针定量PCR在临床医学中的主要问题基因诊断的基因诊断的物质基础及物质基础及与其它与其它诊断方法的诊断方法的区别区别基因诊断免疫学诊断临床诊断细胞膜细胞核DNA转录 mRNA翻译蛋白质临床表现生化诊断临床实验医学发展临床实验医学发展 三个时代三个时代 标志技术标志技术 性质性质生化诊断时代 生化分析 表象免疫学诊断时代 酶免、放免 表象分子(基因)诊断时代 基因体外扩增(PCR) 本质1、病原

2、体的定量检测及药物疗效考评（HBV）2、肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测（P53 ）3、遗传病基因的检测（地中海贫血 ）4、与疾病相关的各种蛋白质的基因表达的定量检测6、建立病原体的分子诊断标准荧光定量荧光定量PCRPCR在临床医学中的应用在临床医学中的应用荧光定量荧光定量PCRPCR在病原体检测中的应用在病原体检测中的应用一、肝炎病毒定量检测二、性病病原体检测三、优生优育相关项目检测四、结核杆菌及呼吸道病原体检测五、其他病原体检测病毒性肝炎概况 病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起，以肝脏炎症和坏死病变为病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起，以肝脏炎症和坏死病变为主的一组传染病。按病毒的生物学

3、特征、临床和流行病学特征，主的一组传染病。按病毒的生物学特征、临床和流行病学特征，1989年在日本东京的国际肝炎学术讨论会上，将其分为甲（年在日本东京的国际肝炎学术讨论会上，将其分为甲（A）型、乙（型、乙（B）型、（）型、（C）型、丁（）型、丁（D）型、戊（）型、戊（E）型肝炎，以后）型肝炎，以后还报道了己（还报道了己（F）型和庚（）型和庚（G）型。）型。 我国是个肝炎大国，病毒性肝炎发病数位居法定管理传染病的我国是个肝炎大国，病毒性肝炎发病数位居法定管理传染病的第一位，仅乙型肝炎病毒感染者就达第一位，仅乙型肝炎病毒感染者就达1.2亿，每年新增加的感染亿，每年新增加的感染者也在百万以上，丙肝发

4、病率亦趋上升。慢性乙型肝炎病程迁者也在百万以上，丙肝发病率亦趋上升。慢性乙型肝炎病程迁延，如得不到及时的治疗，部分将会发展为肝硬化甚至肝癌，延，如得不到及时的治疗，部分将会发展为肝硬化甚至肝癌，严重危害人类健康。严重危害人类健康。HBV基因型与血清型关系及流行病基因型与血清型关系及流行病学分布学分布基基因因型型血清学亚型血清学亚型基因长基因长度度(nt)临床突变率临床突变率主要主要流行地域流行地域PC*(G1896A)BCP*(1762/1764)Badw2ayw1321550（常）（常）T185816东南亚、中国、东南亚、中国、日本日本Cayr;adrq+;Adrq-;adr;adw2321

5、550（常）（常）T1858或或C185858（常）（常）东南亚、中国、东南亚、中国、日本、澳洲、日本、澳洲、美国美国病原学病原学乙型肝炎检测标志物lHBsAg，抗-HBslHBeAg，抗-Hbel抗HBclHBV-DNA乙型肝炎免疫检测和PCR结果异同 “大三阳” PCR结果阴性 抗-HBs阳性，PCR结果阳性荧光定量PCR技术对性传播疾病的检测一、淋球菌（NGH）二、沙眼衣原体、解脲脲原体（CT、UU）(有证）三、梅毒螺旋体（TP）四、单纯庖疹病毒（HSV）五、乳头瘤病毒（HPV）（有证）六、人类免疫缺陷病毒（HIV）PCR技术对性传播疾病检测的注意事项1标本的选取 TP HSV 2临床疗

6、效考评 超高倍荧光定量荧光定量PCRPCR诊断TORCH综合征传统的TORCH病原体：TOX, other, RV, CMV, HSV新近发现的TORCH：麻疹V、腮腺炎V、水痘带状 庖疹V、肠道V、乙肝V、丙肝V、 HPV、EBV、HIV、人庖疹V6、 人微小病毒B19等TORCHTORCH感染的实验室诊断感染的实验室诊断一、组织培养：慢，费力，阳性率低二、血清学诊断： IgG： IgM： 1、不能定量分析 2、抗体的产生受多种因素的影响 3、产生假阳性三、基因诊断方法 原理：检测TORCH病原体的核酸 优点：1、客观指标 2、敏感性、特异性高 3、定量指标 荧光定量PCR在TORCH诊断中

7、的应用： 1、筛选TORCH的患者 2、建立TORCH的分子诊断标准荧光定量荧光定量PCRPCR技术检测技术检测TOX孕妇TOX感染的危害 孕早期（多少，也可对样本稀释后再检测；如低于此范围，则报告多少，如103拷贝数/ml，而不能报告为0拷贝数/ml或阴性。 拷贝数与病原体的关系：拷贝数与病原体的数量成正相关 。一般来说细菌是多拷贝的，病毒是单拷贝的。 DNA拷贝数单位和质量单位：100拷贝HBV0.04fg 国际单位IU拷贝数拷贝数/ml/ml的确定：的确定：DNA/RNA 参考品（质粒等）参考品（质粒等）测量OD260的值得到mg/ml通过与分子量的计算，得到拷贝数/ml 不同实验室得到

8、的结果差别很大。HCVHCV国际单位与拷贝数换算国际单位与拷贝数换算NGI NGI SuperQuant:SuperQuant: 1 IU/mL = 3.4 copies/ml1 IU/mL = 3.4 copies/ml (NGI Product License Application to FDA ) (NGI Product License Application to FDA )Roche Roche Amplicor Monitor v2.0Amplicor Monitor v2.0 1 1 IU/mL = IU/mL = 0.9 copies/ml0.9 copies/ml (Ro

9、che Molecular Systems) (Roche Molecular Systems)Cobas Amplicor Monitor HCV v2.0Cobas Amplicor Monitor HCV v2.0 1 IU/mL = 2.7 copies/ml1 IU/mL = 2.7 copies/ml (Roche Molecular Systems) (Roche Molecular Systems)LCx HCV RNA Quantitative AssayLCx HCV RNA Quantitative Assay 1 IU/mL = 3.8 copies/ml1 IU/mL = 3.8 copies/ml (Abbott Diagnostics)(Abbott Diagnostics)Bayer bDNA 3.0:Bayer bDNA 3.0: 1 IU/mL = 5.2 copies/ml1 IU/mL = 5.2 copies/ml (Bayer Development Group)(Bayer Development Group) 未知未知HCV RNA 样本样本甲实验室 5000拷贝/ml 乙实验室 10000拷贝/ml 丙实验室 50000拷贝/ml 丁实验室 20000拷贝/ml 实验室结果的互通性实验室结果的互通性20