天然产物实验指导

1、实验一 水蒸气蒸馏法提取萜类及挥发油一、实验目的1、了解水蒸汽蒸馏的基本原理和应用，掌握水蒸汽蒸馏的方法。2、掌握萜类和挥发油的提取原理及方法。二、基本原理水蒸汽蒸馏的操作是将水蒸汽通入有机物中，或将水与有机物一起加热，使有机物与水共沸而蒸馏出来的过程。水蒸汽蒸馏是分离和提纯有机物质的常用方法。当两种互不相溶的液体混合在一起时，混合物的蒸气压应为各组分蒸气压之和。由于两种组分互不相溶，彼此相互影响很小，混合物中每一组分在某温度下的分压等于其纯态时在该温度下的蒸气压。当混合物受热至各组分的蒸气压之和等于外界大气压时混合物即沸腾。例如，把苯胺和水的混合物加热至98.4，混合物开始沸腾。因为在98.

2、4时，苯胺的蒸气压为42mmHg，水的蒸气压为718mmHg，两者相加等于760mmHg。显然，苯胺水混合物的沸点既低于苯胺的沸点（184.4），也低于水的沸点。因此，沸点高于100的有机物，利用水蒸汽蒸馏，可以在低于100的温度下蒸馏出来。根据气体分压定律，水蒸汽蒸馏的混合蒸气中个别气体分压（PA、P水）之比等于它们的摩尔数之比（nA、n水表示这两种物质在一定容积的气相中的摩尔数），即：PA：P水= nA：n水 ，因为馏出液是由蒸气冷凝而来的，馏出液中A与水的摩尔数之比同样是nA：n水。而nA = WA / MA，n水= W水/ M水，（MA、M水为A和水的分子量；WA、W水为A和水的重量）

3、。因此有：WA / W水= (MAnA) / (M水n水) = (MAPA) / (M水P水)由上式可见，馏出物中有机物和水的相对重量与其蒸气压和分子量成正比。式中P 水可通过手册查得，PA可近似地以大气压与P水之差计算（PA=P大气P水），P大气可由气压计上读得。例如，将苯胺与水的混合物进行水蒸汽蒸馏，混合沸腾（98.4）时，查水的蒸气压为718mmHg，大气压为760mmHg，P苯胺= 760718 = 42mmHg。苯胺的分子量为93，所以馏出液中苯胺与水和重量比为：W苯胺/ W水= （93×42）/（18×718）=1 / 3.3，即每蒸出3.3g水能够带出1g 苯

4、胺。由于苯胺略溶于水，这个计算所得的仅为近似值。从以上公式和计算可以看出，水蒸汽蒸馏的效率与有机物的分子量MA和蒸气压PA有关，MA愈大；PA愈高，水蒸汽蒸馏的效率也愈高。但由于分子量愈大的物质其蒸气压愈低，因而实际上很难两全。由上述原理可见，使用水蒸汽蒸馏分离提纯有机物应具备以下条件：(1) 不溶于水或难溶于水；(2) 与水长时间煮沸不发生化学变化；(3) 在100左右，必须具有一定的蒸气压（至少5mmHg 以上，（一般不少于1.3332 kPa）。）；水蒸汽蒸馏常用于下列几种情况：(1) 某些沸点高的有机物，在常压下蒸馏虽可与副产品分离，但其本身易破坏；(2) 混合物中含有大量树脂或不挥发

5、性杂质，采取普通蒸馏、萃取等方法都难以分离；(3) 从较多固体反应物中分离出被吸附的液体；(4) 从天然物中提取精油等。三、基本操作1、水蒸汽蒸馏装置如图所示，主要由水蒸汽发生器，长颈圆底烧瓶、直形冷凝管和接受器组成。水蒸气蒸馏有两种方法：种是将水蒸气发生器产生的水蒸气通入盛有被蒸物的烧瓶中，使被蒸物与水一起蒸出；另一种方法是将水加入到装有被蒸物的烧瓶中，与普通蒸馏方法相同，直接加热烧瓶，进行蒸馏，这是一种简化了的水蒸气蒸馏方法；当蒸馏时间较短，不需耗用大量水蒸气时，可采用这种方法。（1）水蒸汽发生器A是金属制品，也可用圆底烧瓶代替。器内盛水约一半（1/2-2/3）。长玻璃管B 为安全管（0.

6、5-1m），管的下端几乎插到发生器的底部（距底部1cm）。当容器内气压太大时，水可沿着玻璃管上升以调节内压。如果蒸馏系统发生阻塞，水便会从玻璃管的上口喷出，此时应检查圆底烧瓶内的蒸气导管下口是否被堵塞。（2）长颈圆底烧瓶D是蒸馏器（加入样品体积不超过1/3），用铁夹在颈下部夹紧，并和桌面成450角，以免飞溅起的液体被蒸气带进冷凝管中。瓶口配双孔软木塞，一孔插入水蒸汽导管C（弯成约125°角与T形管相连），其末端应弯曲，使之垂直正对瓶底中央并接近瓶底，以便水蒸汽和被蒸馏物质充分接触并起搅动作用。此管的外径一般不小于7mm，以保证水蒸汽畅通。另一孔插入水蒸汽导出管E（为30°角

7、），此管应略为粗一些，其外径约为10mm，以便蒸气能畅通地进入冷凝管中。若管E的直径太小，蒸气的导出将受到一定的阻碍，这会增加烧瓶D 的压力，导管E在弯曲处前的一段应尽可能短些，在弯曲处后一段则允许长些，因它可起部分的冷凝作用。由于许多反应是在三口瓶中进行的，直接用该三口瓶作为水蒸气蒸馏的蒸馏瓶就可避免转移的麻烦和产物的损失。（3）长的直型冷凝管F可以使蒸气充分冷却。由于水的蒸发热较大，所以冷却水的流速也宜稍大一些。（3）T 形管发生器A的支管和水蒸汽导入管C 之间用一个T 形管相连接，在T 形管的支管上套一段短橡皮管，用螺旋夹旋紧，打开螺旋夹，可以及时放掉蒸气冷凝形成的水滴。在操作中，如果发

8、生不正常现象，应立刻打开T 形管的夹子，使之与大气相通。2、其它连接方法 A水蒸气发生器；B液面计；C安全管；DT形管；E弹簧夹；F蒸馏瓶；G导气管；HY形管；I蒸馏头；J直形冷凝管；K尾接管；L接收瓶3、操作仪器安装好后，把要蒸馏的物质倒入烧瓶D 中，其量约为烧瓶容量的1/3，操作前，水蒸汽蒸馏装置应经过检查，必须严密不漏气。开始蒸馏时，先把T 形管上的夹子打开，用直接加热法将发生器内的水加热至沸。当有大量的水蒸汽从T 形管的支管流出时再旋紧夹子，让水蒸汽通入烧瓶中，这时可以看到瓶中的混合物翻滚不息，不久就会在冷凝管中出现蒸气冷凝为乳浊液，流入接受器。调节火焰，使瓶内混合物不致飞溅得太厉害，

9、并控制馏出液的速度约为23 滴/s。为了使水蒸汽不致在烧瓶内过多的冷凝，（如被蒸馏的物料较多，温度又较低），可先在圆底烧瓶下放一石棉网，用小火加热。在操作时，要随时注意安全管中的水柱是否发生不正常的上升现象以及烧瓶中的液体是否发生倒吸现象。一旦发生这种现象应立刻打开T 形管上的夹子，移去火源，找出发生故障的原因，才可继续蒸馏。当馏出液澄清透明不再含有有机物质的油滴时，一般即可停止蒸馏。此时应首先打开T形管的夹子，然后移去火源，否则D中的液体会倒吸到A中。蒸馏期间，应及时排出T形管中冷凝水。四、仪器药品1、仪器设备水蒸馏发生器，长颈圆底烧瓶，蒸馏装置（减压），直形冷凝管，接引管，长玻璃管，T 形

10、管，橡皮管（附螺旋夹），三角烧瓶，分液漏斗、研钵等。2、试剂蒸馏样品（八角茴香或橙皮），二氯甲烷，无水亚硫酸钠。五、实验步骤1、设备安装 参照实验原理部分。2、样品准备（1）10g干果（固体物质）于研钵中粉碎，倒入蒸馏瓶，加入蒸馏水30mL。（2）2-3个橙子皮，剪碎，加入到蒸馏烧瓶，并加入水约30mL。3、水蒸汽蒸馏先把T形管上的夹子打开，加热水蒸汽发生器使水迅速沸腾，当有水蒸汽从T形管的支管冲出时，再夹上止水夹，让水蒸汽通入烧瓶中，与此同时，接通冷却水，用100 mL 三角烧瓶收集馏分。蒸馏期间，应及时排出T形管中冷凝水。当馏分澄清透明不再有油状物时，即可停止蒸馏，先打开止水夹，然后停止加

11、热，把馏分倒入分液漏斗中，静置分层，将水层弃去。（以下为选做部分）4、收集馏出夜60-70mL，于分液漏斗中每次用10mL二氯甲烷萃取3次，合并。倒入锥形瓶中，加入适量无水亚硫酸钠干燥30min以上，除去部分水分。5、干燥完毕的样品，于50mL蒸馏烧瓶水浴加热蒸馏（二氯甲烷沸点40.4），待快完毕后，改用水泵减压蒸馏。除去残留的二氯甲烷，留下橙黄色油状液体（橙皮产物）。六、思考题1、与普通蒸馏相比，水蒸汽蒸馏有何特点？在什么情况下采用水蒸汽蒸馏的方法进行分离提取？ 答：与普通蒸馏相比，水蒸汽蒸馏多了一个水蒸汽发生装置，蒸馏部分不再保持垂直，而是倾斜3045°。其余部分一样。使用水蒸汽

12、蒸馏提纯的有机物应具备下列条件：不溶或难溶于水；与水长时间煮沸不发生化学反应；在1000C左右时，待提纯物应具有一定的蒸汽压。2、安全管为什么不能抵至水蒸汽发生器的底部？ 答：安全管是用来调节水蒸汽发生器内部的压力，内部压力过大，水就会从安全管的上口喷出。如果抵至发生器的底部，则安全管失去调节压力的作用。3、蒸馏过程中若发现水从安全管顶端喷出或发生倒吸现象，应如何处理？ 答：应迅速打开螺丝夹，让体系与大气相通。进而再进一步检查导致压力过大的原因，排除故障后，继续实验。实验二人参中人参皂苷的提取分离及鉴定一、实验目的1、通过实验进一步掌握三萜类化合物的理化性质及提取、分离和检识方法。2、学习和掌

13、握简单回流提取法、两相溶剂萃取法、旋转蒸发器、大孔树脂柱色谱等基本实验操作技能。二、基本原理人参为五加科植物人参(Panax ginseng C.A.Mey. )的干燥根，是传统名贵中药，始载于我国第一部本草专著神农本草经。其栽培者称为“园参”，野生者称为“山参”。人参具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津、安神之功能，用于体虚欲脱、肢冷脉微、脾虚食少、肺虚喘咳、津伤口渴、内热消渴、久病虚羸、惊悸失眠、阳痿宫冷、心力衰竭、心源性休克等的治疗。人参的化学成分很复杂，有皂苷、挥发油、糖类及维生素等。经现代医学和药理研究证明，人参皂苷为人参的主要有效成分，它具有人参的主要生理活性。人参的根、茎、叶、

14、花及果实中均含有多种人参皂苷(ginsenosides)。到目前为止，文献报道从人参根及其它部位已分离确定化学结构的人参皂苷有人参皂苷-Ro、-Ra1、-Ra2 、-Rb1、-Rb2、-Rb3、-Rc、-Rd、-Re、-Rf、-Rg1、-Rg2、-Rg3、-Rh1、-Rh2及-Rh3 等50余种人参皂苷。根据皂苷元的结构可分为A、B、C三种类型：人参二醇型-A型，人参三醇型-B型，齐墩果酸型-C型。A型和B型皂苷均属四环三萜皂苷，其皂苷元为达马烷型四环三萜，A型皂甙元称为20(S)-原人参二醇20（S）-protopanaxadiol。B型皂甙元称为20(S)-原人参三醇20（S）-proto

15、panaxatriol。C型皂苷则是齐墩果烷型五环三萜的衍生物，其皂苷元是齐墩果酸(oleanolic acid)。人参的主要成分为人参皂苷，总皂苷含量约4，人参皂苷大多数是白色无定形粉末或无色结晶，味微甘苦，具有吸湿性。人参皂苷易溶于水，甲醇、乙醇，可溶于正丁醇、乙酸、乙酸乙酯，不溶于乙醚、苯等亲脂性有机溶剂。水溶液经振摇后可产生大量的泡沫。人参总皂苷无溶血作用，分离后，B型和c型人参皂苷有显著的溶血作用，而A型人参皂苷有抗溶血作用。 人参中除含有皂苷外，还含有脂溶性成分如挥发油，脂肪、甾体化合物及大量的糖类等，这些类成分对人参皂苷的分离和精制有干扰，所以必须除去，方可得到纯度较高的皂苷。本

16、实验以人参根为原料提取分离人参总皂苷，利用人参总皂苷易溶于甲醇，不溶于乙醚性质采用溶剂法进行初步提取去杂；然后根据皂苷在含水丁醇中有较好的溶解度的性质采用萃取法进行分离；再用沉淀法或大孔吸附树脂法进行进一步分离精制；对提出的总皂苷采用检测三萜类化合物通性的理化检识方法泡沫试验及显色反应进行初步定性检识；最后根据人参总皂苷中各单体皂苷分子结构中糖基个数和羟基数不同而极性大小不同的性质，通过薄层色谱法对人参总皂苷进一步分离和专属定性检识。三、仪器药品1、仪器索氏提取器，加热装置，减压蒸馏装置，分液漏斗，60目筛，滤纸，烧杯，试管，D101型大孔树脂柱（包括泵及软管），水浴锅，硅胶-CMC薄层板，超

17、声波仪，展层缸，紫外灯。2、试剂 人参根，甲醇，乙醚，丙酮，三氯化锑氯仿饱和溶液（1精馏氯仿：用蒸馏水洗涤市售氯仿23次，加一些煅烧过的碳酸钠或无水硫酸钠进行干燥，并在暗色烧瓶中蒸馏。2三氯化锑氯仿饱和溶液：用少量精馏氯仿反复洗涤三氯化锑，直到氯仿不再显色为止。再将三氯化锑放在干燥器中，用硫酸干燥。用干燥的三氯化锑和精馏氯仿配制饱和溶液），正丁醇，浓硫酸，冰醋酸，醋酸酐，20五氯化锑的氯仿溶液(或不含乙醇和水的三氯化锑饱和的氯仿溶液)，乙酸乙酯，乙醇，人参皂苷Rb1、Re、Rg1对照品。四、 实验内容1、人参总皂苷的提取分离任选一种方案方案(1)人参根粗粉（60目10g）用滤纸筒包好，置索氏提

18、取器中， 加甲醇加热回流提取至三氯化锑氯仿饱和溶液反应呈阴性， 提取液减压回收甲醇浸膏 用10倍量蒸馏水溶解 水溶液用乙醚在分液漏斗中，振摇脱脂4次 乙醚液（脂类） 水层用水饱和的正丁醇萃取6次，合并正丁醇液减压回收正丁醇，蒸干 残留物（总皂苷粗品）方案(2)人参根粗粉（60目10g）用滤纸筒包好，置索氏提取器中， 加10倍量乙醚回流脱脂至无色， 乙醚液（脂类） 残渣加甲醇加热回流提取至三氯化锑氯仿饱和溶液反应呈阴性甲醇提取液 减压回收甲醇浸膏 用10倍量蒸馏水溶解 水溶液用水饱和的正丁醇萃取6次，合并正丁醇液减压回收正丁醇，蒸干 残留物（总皂苷粗品）2、人参总皂苷的分离精制将人参总皂苷粗品分

19、为两份方法（1）沉淀法1份总皂苷粗品甲醇溶解，倾入约10倍量丙酮，不断搅拌，析出 黄白色沉淀 母液过滤 回收溶剂，用少量甲醇溶解，再倾入约10倍量丙酮总皂苷 黄白色沉淀 过滤总皂苷 合并，减压60下真空干燥，称重计算收率 精制总皂苷方法（2）大孔树脂柱色谱法大孔树脂色谱是近年来用于分离和富集天然化合物的一种常用方法，应用大孔树脂分离皂苷，主要用于皂苷的富集和初步分离。将含有皂苷的水溶液通过大孔树脂柱吸附后，先用水洗脱除去糖和其他水溶性杂质，然后改用不同浓度的甲醇或乙醇进行梯度洗脱。极性大的皂苷可被低浓度的甲醇或乙醇洗脱下来，极性小的皂苷则被高浓度的甲醇或乙醇洗脱下来。1份总皂苷粗品 用少量水溶

20、解，加样于处理好的D101型大孔树脂柱上，吸附1小时后，用3倍柱体积蒸馏水洗脱除杂质 继用60%乙醇洗脱至三氯化锑氯仿饱和溶液反应呈阴性 洗脱液 减压回收溶剂 残留物 减压60下真空干燥，称重计算收率精制总皂苷3、人参皂苷的鉴定（一）理化检识1、泡沫试验取人参根粗粉1g，加水浸泡（1：10）1小时或置80水浴上温浸30分钟，过滤得滤液供以下试验。取供试液2ml于试管中，紧塞试管口后猛力振摇，试管内液体则产生大量的持久性的似蜂窝状泡沫（示有皂苷）。注：含蛋白质和粘液质的水溶液虽也能产生泡沫，但不持久，放置很快消失。2、显色反应（1）醋酐浓硫酸反应（Liebermann-Burchard反应）取样

21、品适量，加冰醋酸0.5mL使溶解，续加醋酐0.5mL搅匀，再于溶液的边沿滴加1滴浓硫酸，观察并记录现象。（2）三氯甲烷浓硫酸反应（Salkowski反应）取样品适量，加三氯甲烷1mL使溶解，沿试管壁加等量的浓硫酸，分别置可见光及紫外灯下，观察并记录现象。（3）五氯化锑反应（Kahlenberg reaction） 取样品适量，加五氯化锑的氯仿溶液反应呈紫色。或将样品的氯仿或醇溶液点于滤纸上，喷20五氯化锑的氯仿溶液(或不含乙醇和水的三氯化锑饱和的氯仿溶液)，干燥后6070加热，显色，观察并记录现象。(二)色谱检识1、薄层色谱吸附剂：硅胶-CMC薄层板样品溶液：称取由沉淀法及大孔吸附树脂法制得的

22、精制总皂苷各一份，加甲醇制成1mL含2mg的样品溶液。对照品溶液：称取人参皂苷Rb1、Re、Rg1对照品，加甲醇制成1mL含2mg的对照品混合溶液。对照药材溶液：取人参对照药材粉末1 g，加氯仿40mL，置水浴上回流1小时，弃去氯仿液，药渣挥干残存溶剂，加水0.5mL拌匀湿润后，加水饱和的正丁醇10mL，超声处理30分钟，吸取上清液，加氨试液三倍量，摇匀，放置分层，取上层液蒸干加甲醇溶解，使成1mL，作为对照药材溶液。展开剂：A. 氯仿-甲醇-水(65：35：10)10以下放置后的下层溶液;B. 氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15：40：22：10) 10以下放置后的下层溶液;显色剂：10%硫酸乙

23、醇溶液 显色方式：10%硫酸乙醇溶液喷雾后，105加热至斑点显色清晰。分别置日光及紫外灯(365nm)下检视.五、实验说明及注意事项1、萃取操作时，注意振摇不能过度剧烈，以防产生乳化现象。2、在使用旋转蒸发器进行甲醇提取液减压浓缩时，因含皂苷易产生大量泡沫发生倒吸现象。故应注意观察随时调整水浴温度及旋转蒸发器转速，避免事故的发生。3、在连续回流提取过程中，水浴温度不宜过高，应与溶剂沸点相适应。此外可加快冷凝水的流速，以增加冷凝效果。4、回收乙醚的蒸馏操作，不必另换蒸馏装置。只将索氏提取器中的滤纸筒取出，再照原样装好，继续加热回收烧瓶中的溶剂，待溶剂液面增加至高虹吸管顶部弯曲处1cm处，暂停回收

24、，取下提取器，将其中乙醚移置另外容器中，如此反复操作，即可完成回收乙醚的操作。5、在连续提取过程中，欲检查有效成分是否提取完全，可取提取器中提取液数滴，滴于白瓷皿中，挥散溶剂，观察有无残留物，或滴于滤纸片上，然后进行醋酐浓硫酸反应或三氯化锑氯仿饱和溶液反应。若反应呈阴性，示已提尽。6、大孔树脂在使用前应按说明书处理好，加乙醇浸泡24 h后，再用乙醇洗脱至流出液与3倍水混合后不呈混浊，继续用蒸馏水洗至无醇为止备用。六、思考题1、三萜皂苷可用哪些反应进行鉴定？如何与甾体皂苷区别？2、试设计一种从人参茎叶为原料提取分离人参总皂苷的工艺流程，并说明提取、分离原理。3、使用乙醚作提取溶剂时，操作中应注意

25、哪些事项？实验三、-胡萝卜素和番茄红素的提取分离与测定一、实验目的1、掌握从胡萝卜或番茄中提取分离-胡萝卜素和番茄红素的原理与方法。2、巩固用柱色谱和薄层色谱分离、检测有机化合物的实验技术。3、学会用分光光度法测定-胡萝卜素和番茄红素的方法。二、实验原理-胡萝卜素和番茄红素分子中的碳骨架是由8个异戊二烯单位连接而成的，它们是四萜类化合物。它们的分子中都有一个较长的-共轭体系，能吸收不同波长的可见光，因而，它们都呈现一定的颜色，-胡萝卜素是黄色物质，番茄红素是红色物质，所以，又把它们叫做多烯色素。胡萝卜素是最早发现的一个多烯色素。后来，又发现了许多在结构上与胡萝卜素类似的色素，于是就把这类物质叫

26、做胡萝卜色素类化合物，或者叫做类胡萝卜素。这类化合物大都难溶于水，易溶于弱极性或非极性的有机溶剂，因此又把这类物质叫做脂溶性色素。胡萝卜素广泛存在于植物的叶、花、果实中，尤以胡萝卜中含量最高。胡萝卜素有、三种异构体，在生物体中以-异构体含量最多，生理活性最强。在动物体内，胡萝卜素在酶的作用下可转化为维生素A，因此，胡萝卜素又被叫做维生素A原。胡萝卜素在人和高等动物体内具有重要的生理功能，是人和高等动物生存不可缺少的营养物质。番茄红素是胡萝卜素的开链异物体。番茄红素在成熟的红色植物果实如番茄、西瓜、胡萝卜、草莓、柑桔等中含量最高，其中含量最多的是番茄。由于番茄红素不具有维生素A原活性，因此长期以

27、来不被人们所重视。但近年来研究表明，番茄红素是一种优越的天然色素和生物抗氧化剂，它可以预防前列腺癌、乳腺癌和消化道（结肠、直肠与胃）癌的发生，在预防心血管疾病、动脉硬化等各种与衰老有关的疾病及增强机体免疫力方面具有重要作用。正因为如此，近年来国内外对番茄红素的研究方兴未艾，不仅有大量的研究文章公开发表，而且还有一些相关产品面市。番茄红素作为新型保健食品、食品添加剂、化妆品和药品具有广阔的市场前景。-胡萝卜素和番茄红素的分子式均为C40H56，分子量为536.85，-胡萝卜素的熔点184，番茄红素的熔点174。-胡萝卜素和番茄红素是不饱和碳氢化合物，难溶于甲醇、乙醇，可溶于乙醚、石油醚、正已烷、

28、丙酮，易溶于氯仿、二硫化碳、苯等有机溶剂。根据-胡萝卜素和番茄红素的上述性质，故可利用石油醚、乙酸乙酯等弱极性溶剂将它们从植物材料中浸提出来。然后，根据它们对吸附剂吸附能力的差异，用柱色谱进行分离，用薄层色谱检测分离效果。并根据它们在可见光区有强烈吸收的性质，用紫外可见分光光度法进行测定，-胡萝卜素的最大吸收峰为451nm，番茄红素的最大吸收峰为472nm。三、仪器与试剂1、仪器 三角瓶（50ml）、分液漏斗（150ml）、蒸馏瓶（50ml）、普通蒸馏装置（或减压蒸馏装置）、色谱柱、硅胶薄层板、量筒、烧杯、试管、分光光度计、层析缸。2、试剂番茄（或番茄酱）或胡萝卜、食盐、丙酮、乙酸乙

29、酯、石油醚（6090）、乙醇、无水硫酸镁、氧化铝（层析用，100200目）、硅胶（层析用，200300目）、无水硫酸钠、石油醚（6090）：乙醇（2：1）（V/V）、石油醚：丙酮（3：2）（V/V）。四、实验内容与步骤1、类胡萝卜素的提取方法一：（1）称取20g新鲜番茄果肉，捣碎，置于50mL三角瓶中，再加入5g食盐，用玻棒搅拌，使食盐与番茄果肉充分混合均匀，设置一定时间，便会看到果肉组织中水分大量渗出。脱水时间持续1530min。随后将脱除下来的水分滤入150mL分液漏斗中。（2）向经过食盐脱水的番茄果肉加入10mL丙酮，用玻棒搅拌，并静置510min。然后将丙酮提取液也滤入分液漏斗中。（3

30、）向经过丙酮处理的番茄果肉加入10mL乙酸乙酯浸提5min。浸提过程中应不时振摇三角瓶，使番茄果肉与溶剂充分接触；若室温过低，可将三角瓶置于温水浴中温热，但应注意不能使浸提溶剂明显挥发损失。5min后将提取液也滤入分液漏斗中，并用玻棒轻压残渣尽量使溶剂流尽。再用乙酸乙酯重复提取2次，每次10mL，合并提取液至分液漏斗中。（4）充分振摇分液漏斗中的混合溶液，静置，完全分层后，分去水层，有机层（酯层）再用蒸馏水洗2次，每次810mL，弃去水层。酯层自分液漏斗上口倒入干燥的小三角瓶中，加入适量无水硫酸镁（或无水硫酸钠）干燥15min（注意：应避光）。（5）干燥后的酯层滤入50mL干燥的蒸馏瓶中，水浴

31、加热，小心蒸馏（最好减压蒸馏）浓缩至12mL。所得浓缩液即为类胡萝卜素样品。方法二：称取20g新鲜番茄果肉，捣碎，置于50mL三角瓶中，用15mL石油醚（6090）与乙醇的混合溶剂（2：1，V/V）浸提5min。然后将提取液滤入150mL分液漏斗中。再用石油醚乙醇混合溶剂重复提取2次，每次15mL。合并提取液至分液漏斗中。以下步骤同方法一（4）、（5）。2、类胡萝卜素的柱色谱分离方法一：选一支1.5×20cm色谱柱，用适量层析用氧化铝（100200目）作吸附剂干法装柱，高度约1020cm，要求紧密匀实。分离方式为梯度洗脱，第一步用石油醚（6090）洗脱。先沿色谱柱管壁滴加58mL石油

32、醚至柱体（各方向要均匀），待溶剂液面降至氧化铝柱面顶端时，用滴管迅速地小心滴加510滴样品至柱子中，待样品液面即将在柱面上消失时，沿管壁小心滴加石油醚3-5滴，冲洗粘在管壁上的有色物质。如此重复操作3-4次，直至管壁冲冼干净为止。随后，在管内加入尽可能多的石油醚进行洗脱，第一步收集到的洗脱液为黄色。待洗脱液清亮无色后用石油醚：丙酮=3：2（V/V）的混合液洗脱，第二步收集到的洗脱液为红色。最后用丙酮将前两步不能洗脱的剩余组分洗脱下来。分别收集三步洗脱液，用作薄层色谱检测及分光光度法测定。方法二：操作步骤与方法一基本相同，只是分离方式不一样。本方法用石油醚作流动相进行一步洗脱，分别接收不同颜色的

33、洗脱液，作后续步骤实验用。并将本方法的分离效果与方法一进行比较。3、类胡萝卜素的薄层色谱检测对前面得到的类胡萝卜素样品以及柱色谱分离得到的样品分别进行薄层分析，以检查柱色谱分离效果。薄层层析板预先用硅胶G制备并活化（110，1小时），展开剂为石油醚（60-90）：丙酮=3：2（V/V）。薄层分离后观察斑点位置，计算各斑点的Rf值，并明确各斑点归属。在本实验条件下，薄层检测结果为：-胡萝卜素，黄色，Rf值为0.89；番茄红素，深红色，Rf值为0.84。4、类胡萝卜素的分光光度法测定取柱色谱分离后得到的样品，用石油醚适当稀释至仪器测量范围，然后用721型分光光度计分别在420520nm范围测定它们

34、的光密度E，并做出E-曲线（每隔10nm测定一次光密度）。指出各自最大吸收峰max，并与标准吸收对照鉴定。注释：新鲜番茄果肉组织中含有大量水分，类胡萝卜素处在含水量很高的细胞环境中，有机溶剂不易渗透进去，因此，为了提高提取效率，减少提取溶剂用量，应首先用食盐对番茄果肉进行脱水处理。经食盐一次脱水处理后，番茄果肉里仍然含有一定量水分，致使所用提取溶剂还是无法进入细胞内很好地将类胡萝卜素溶出，故选用弱极性溶剂丙酮对之进一步脱水，同时也会溶出部分类胡萝卜素。为了最大限度地减少类胡萝卜素的损失，故应将前步脱除下来的水分及这一步的丙酮浸提液都滤入分液漏斗中合并处理。经丙酮处理后的番茄果肉便可直接加有机溶

35、剂浸提。如果用番茄酱或胡萝卜做原料提取类胡萝卜素，食盐脱水及丙酮进一步脱水处理这些步骤便可省去。浓缩提取液时应当用水浴加热蒸馏瓶，最好用减压蒸馏，而且不可蒸得太快、太干，以免类胡萝卜素受热分解破坏。如用乙酸乙酯提取胡萝卜素，提取液浓缩至12ml后，应停止蒸馏，拆卸仪器，将蒸馏瓶敞口，让剩余的乙酸乙酯挥发至干，然后再加适量石油醚溶解，所得溶液即为类胡萝卜素样品，用于下一步实验。切不可将经过浓缩的乙酸乙酯提取液直接用于柱色谱分离。在提取及柱色谱分离两步中，本实验分别提供了两种方法。实验过程中，可将全班学生分为两批，分别按不同方法进行实验，实验结束后，再让学生通过比较得出应有的结论。五、思考题1、根

36、据本实验结果，试提出一个从植物材料中提取、分离、鉴定植物色素的一般流程。2、柱色谱分离类胡萝卜素实验中，黄色物质、红色物质各是什么色素？试就实验现象作出解释。3、在类胡萝卜素的薄层色谱检测中，你究竟观察到了几个斑点？它们的Rf值各是多少？如实记录实验现象，并对实验现象做出解释。此外介绍纸层析法和柱色谱法一、纸层析法1.原理以丙酮和石油醚提取食物中的胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离，剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于450nm波长下定量测定。2.适用范围参照GB12389-90。本方法适用于植物性食物和含有植物性食物的混合食物中胡

37、萝卜素的测定，其最小检出限为0.11g。3.仪器和设备（1） 实验室常用设备。（2） 玻璃层析缸。（3） 分光光度计。（4） 旋转蒸发器：具150mL球形瓶。（5） 恒温水浴锅。（6） 皂化回馏装置。（7） 点样器或微量注射器。（8） 滤纸。4.试剂除特殊说明外，实验用试剂为分析纯，水为蒸馏水。4.1 石油醚（沸程3060）：同时是展开剂。4.2 无水硫酸钠：分析纯。4.3 5%硫酸钠溶液。4.4 1+1氢氧化钾溶液：取50g氢氧化钾溶于50ml水。4.5 无水乙醇：需脱醛处理。（1） 检验乙醇是否含醛：银氨液：加浓氨水于5%硝酸银液中，直至氧化银沉淀溶解，加入2.5mol/L氢氧化钠溶液数滴

38、，如发生沉淀，再加浓氨水使之溶解。银镜反应：加2ml银氨液于试管内，加入几滴乙醇摇匀，加入少许2.5mol/L氢氧化钠溶液加热。如乙醇中无醛，则没有银沉淀，否则有银镜反应。（2）脱醛方法：取2g硝酸银溶于少量水中，取4g氢氧化钠溶于温乙醇中，将两者倾入1L乙醇中，摇匀，静置一、两天，将上层清液倾入蒸馏瓶中，蒸馏，弃去初蒸的50ml。（注：蒸馏速度控制在1滴/秒。）4.6 -胡萝卜素标准贮备液：取5mg-胡萝卜素标准品，溶于10ml三氯甲烷中，浓度约为500g/ml，准确测其浓度。（1） 标定： 取标准溶液10.0l， 加正己烷3.00ml，混匀。测其吸光度值，比色杯厚度为1cm，以正己烷为空白

39、，入射光波长450nm，平行测定三份，取均值。（2） 计算公式： X1=A×1×3.01（1）E10000.01式中： X1-胡萝卜素标准溶液浓度，mg/ml；A -吸光值；E-胡萝卜素在正己烷溶液中，入射光波长450nm，比色杯厚度1cm，溶液浓度为1ppm的吸光系数，为0.2638；1将ppm换算成mg/ml；10003.01测定过程中稀释倍数的换算。0.01（注：配制标准溶液时，应注意标准品的结构是胡萝卜素还是胡萝卜素酯。通常标准品不能完全溶解于有机溶剂中，尤其是胡萝卜素酯，所以必要时应先将标准品进行皂化，再用有机溶剂提取，用蒸馏水洗涤至中性后，浓缩定容。再进行标定。

40、由于胡萝卜素很容易分解破坏，所以每次使用前标准品均需标定，且测定样品时需带标准品同步操作。）4.7 -胡萝卜素标准工作液：将已标定的标准液用石油醚准确稀释，使每毫升溶液相当50g，避光保存于冰箱中。5.操作步骤5.1样品的采集和处理（1） 粮食：样品用水洗三次，置60烤箱中拷干，磨粉，储于塑料瓶中，放一小包樟脑精，盖紧瓶塞保存，备用。（2） 蔬菜与其他植物性食物：取可食部用水冲洗三次后，用纱布吸去水滴，切碎，用匀浆器制成匀浆，贮于塑料瓶中，冰箱内保存备用。5.2测定步骤（以下步骤需在避光条件下进行）（1）样品提取：取适量样品，相当于原样15g（含胡萝卜素约2080g）匀浆，粮食样品视其胡萝卜素

41、含量而定，置100ml带塞锥形瓶中，加入丙酮20ml，石油醚5ml，振摇1min，静置5min，将提取液转入盛有100ml5%硫酸钠溶液的分液漏斗中，再于锥形瓶中加入10ml丙酮-石油醚混合液，振摇1min，静置5min，将提取液并入分液漏斗中。如此提取23次，直至提取液无色为止。 植物油和高脂肪样品：需先皂化，取适量样品（<10g），加脱醛乙醇30ml，再加10ml1:1氢氧化钾溶液，回流加热30min，然后用冰水使之迅速冷却，皂化后样品用石油醚提取，直至提取液无色为止。（注：原国标方法中，不是所有的样品均进行皂化处理。但是许多植物性样品由于细胞壁较厚，在匀浆或研磨过程中不易完全破坏，

42、使胡萝卜素无法完全释放。并且尽管植物性样品中脂肪含量较少，但仍含有一定脂质成分，如果不进行皂化，会出现提取不完全和提取时出现乳化现象；浓缩时残留脂质，使定容体积不准确；纸层析展开不完全，造成测定结果偏移。所以建议除酒类、饮料外所有样品均进行皂化处理。）（2）洗涤：将提取液静置分层，弃去下层水溶液，反复用5%硫酸钠溶液振摇洗涤，每次约15ml，直至下层水溶液清亮为止。将皂化后样品提取液用水洗涤至中性。将提取液通过盛有10g无水硫酸钠的小漏斗，漏入球形瓶，用少量石油醚分数次洗净分液漏斗和无水硫酸钠层内的色素，洗涤液并入球形瓶内。（注：经过无水硫酸钠辅助过滤，提取液中应不含水分。）（3）浓缩与定容：

43、将上述球形瓶内的提取液于旋转蒸发器上减压蒸发，水浴温度为60，蒸发至约1ml时，取下球形瓶，用氮气吹干，立即加入2.00ml石油醚定容，备层析用。（4）纸层析（滤纸先在饱和水蒸气的空气中吸收水分后(一般吸收约70)，其一部分生成水合纤维素配位化合物，固定在滤纸上作固定相）点样：在18cm×30cm滤纸下端距底边4cm处做一基线，在基线上取A、B、C、D四点，吸取0.1000.400ml浓缩液（6.3）在AB和CD间迅速点样。（注意：保持滤纸干燥，点样应该快速细致，在基线上形成细窄直线）展开：待纸上所点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，置于预先用石油醚饱和的层析缸中，进行上行展开。（

44、注：层析缸应事先用石油醚饱和，并且防止水分进入。）洗脱：待胡萝卜素与其他色素完全分开后，取出滤纸，自然挥发干石油醚，将位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带剪下，立即放入盛有5ml石油醚的具塞试管中，用力振摇，使胡萝卜素完全溶入试剂中。（5）比色测定：用1cm比色杯，以石油醚调零点，于450nm波长下，测吸光度值，以其值从标准曲线上查出胡萝卜素的含量，供计算时使用。（6）标准工作曲线绘制：取胡萝卜素标准使用液（浓度为50g/ml）1.00、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00ml，分别置于100ml具塞锥形瓶中，按样品测定步骤进行提取、洗涤、纸层析等操作，点样体积为0.100ml，标准曲线

45、各点胡萝卜素含量依次为2.50、5.00、7.50、10.00、15.00、20.00g。为测定低含量样品，可在0至2.50g间加做几点，以胡萝卜素含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。6.计算X2=c×V2×100×1（2）V1m1000式中： X2-样品中胡萝卜素的含量，以胡萝卜素计，mg.100g；c -在标准曲线上所查得的胡萝卜素含量，g；V1-点样体积，ml；V2-样品石油醚提取液浓缩后的定容体积，ml；m -样品质量，g。7.注意事项同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值10%。二、柱色谱法1. 原理和适用范围同纸层析法，只是将纸层析换

46、成中性氧化铝柱层析。2.试剂（1） 中性氧化铝：80100目。用前180烘干4小时至恒重。（2） 其余试剂同纸层析法。3.仪器及设备（1）色谱柱：为1.0cm×25cm的玻璃柱，底端收缩变细，并有一活塞，用于调控液体流速；距底端上1cm处有一筛板，孔径为1630m。用前需干燥。（2） 其余设备同纸层析法。4.操作步骤4.1样品采集和处理同纸层析法。4.2测定步骤（1） 样品提取、洗涤等步骤同纸层析法。（2） 将洗涤后提取液浓缩并定容至10ml。（3）柱色谱：将已干燥的中性氧化铝浸泡于石油醚中，以湿法填充色谱柱至高度为15cm，其上端加2cm无水Na2SO4，使石油醚自由流下，保证其水

47、平高于Na2SO4平面0.5cm。（注意色谱柱填充时应避免水分，不要有气泡进入。）将样品提取液加入色谱柱上，自由流下，待提取液流至柱面时，分次加入石油醚2ml，洗涤柱壁，再加入石油醚洗脱，收集流出液至黄色带全部流出。流出液经60水浴减压蒸馏后，N2吹干，定容。（4） 比色法测定同纸层析法。5.注意事项（1）柱色谱法的优点是在测定胡萝卜素的同时可测定其他类胡萝卜素和色素。类胡萝卜素、色素和胡萝卜素的极性不同，胡萝卜素极性最小先被极性小的石油醚洗脱，增加洗脱液极性（如加入乙醚、丙酮）可先后将极性稍大的类胡萝卜素（如叶黄素、叶红素）、叶绿色洗脱。（2）纸层析法和柱色谱法均不能区分-、-和-胡萝卜素，

48、虽然标准品为-胡萝卜素，但实际结果为总胡萝卜素。不过天然食品中大部分为-胡萝卜素，对结果影响不大。两种方法测定结果相当。（3）HPLC的原理、适用范围、样品前处理及操作同纸层析法，浓缩定容后的样品液不经过纸层析，而进入HPLC的C18柱，经流动相洗脱后，用紫外分光光度计检测。HPLC可分离-、-胡萝卜素并可同时测定多种脂溶性维生素，是目前国内外常用的测定方法。中草药化学成分检出试剂配制法 "=yaeEp ?1OS%RBF *<Qn)Az X*%KR4 $FO(wf ?LvZEiJ 一、生物碱沉淀试剂： bh uA, nW7L 1碘化铋钾（Dragendorff）试剂：取次硝酸铋

49、3g溶于30%硝酸（比重1.18）17ml中，在搅拌下慢慢加碘化钾浓水溶液（27克碘化钾溶于20ml水），静置一夜，取上层清液，加蒸馏水稀释至100ml。 YnE/bmx&9 e-k;V7b 附：改良的碘化铋钾试剂： w(.k6:e v0= Hy m 甲液：0.85g次硝酸铋溶于10ml冰醋酸，加水40ml。 oh#6>| hL 1qS 乙液：8g碘化钾溶于20ml水中。 vPSH GG%j+Ed 溶液甲和乙等量混合，于棕色瓶中可以保存较长时间，可作沉淀试剂用，如作层析显色剂用，则取上述混合液1ml与醋酸2ml，混合即得。 -4;QB? UiaY0 .D 目前市场上碘化铋钾试剂可

50、直接供配制：7.3g碘化铋钾，冰醋酸10ml，加蒸馏水60ml。 BNu zlR :6N:4 2碘化汞钾（Mayer）试剂：氯化汞1.36g和碘化钾5g各溶于20ml水中，混合后加水稀释至100ml。 Bb8lklQ mi%d()%< 3碘一碘化钾（Wagner）：试剂：1g碘化钾液于50ml，加热，加2ml醋酸，再用水稀释至100ml。 Hc5 gN YDCs d5 4硅钨酸试剂：5g硅钨酸溶于100ml水中，加盐酸少量至pH2左右。 Wi hQj rsOon2| 5苦味酸试剂：1g苦味酸溶于100ml水中。 y3czDjV T_y 'cvh 6鞣酸试剂：鞣酸1g加乙醇1 ml

51、溶解后再加水至10ml。 fPZBm&C 'O YL(j_e 7碱酸铈硫酸试剂：0.1g硫酸铈混悬于4ml水中，加入1g三氯醋酸，加热至沸，逐滴加入浓硫酸至澄清。 Ga+b>C #xm<|s 二、苷类检出试剂： EYcvD!1g zf5sw.4 （一）糖的检出试剂： $xUKppn J37 35 1碱性酒石酸铜（Fehiling）试剂：本口分甲液与乙液，应用时取等量混合。 !o-y= C!Y|k.p 甲液：结晶硫酸酮6.23g，加水至100ml。 )j',e $m Rs|W; 乙液：酒石酸钾钠34.6g，及氢氧化钠10g，加水至100ml。 ,B5Ptf#

52、&oWWc$ 2-萘酚（Molisch）试剂。 $P866F rPaD#GA7 甲液：-萘酚1g，加75%乙醇至10ml。 YRG+I GX eG"iJ%I 乙液：浓硫酸 d;m Q=k 1 pvI(hjMYPk 3氨性硝酸银试剂：硝酸银1g，加水20ml溶解，注意滴加适量的氨水，随加随搅拌，至开始产生的沉淀将近全溶为止，过滤。 N!SGX+ Wq<>a;m 4-去氧糖显色试剂 r;|Bc$P 2muhJ （1）三氯化铁冰醋酸（Keller-Kiliani）试剂 eb9qg.9Z K<ygcWE 甲液：1%三氯化铁溶液0.5ml，加冰醋酸至100ml。 ;4

53、 ?%k ) LaN4%;X1- 乙液：浓硫酸。 U?$v 1| Vg:P6s （2）占吨氢醇冰醋酸（Xanthydrol）试剂：10mg占吨氢醇溶于100ml冰醋酸（含1%的盐酸中） ec=4LV* zN2sipJS8 （二）酚类 ulj+D?H q8kt_&Ij 1三氯化铁试剂：5%三氯化铁的水溶液或醇溶液。 gvcT_' qZ1fQN1yG 2三氯化铁一铁氰化钾试剂： mYb|cS3p$ )3G?5 OTS 甲液：2%三氯化铁水溶液 b%)a5H( 8=2)I. 乙液：1%铁氰化钾水溶液 ?L. n:wu CX1'B0=r 应用时甲液、乙液等体积混合或分别滴加。

54、V'6%G:?0a 7vHU49DV 3、4一氨基氨替比林一氨氰化钾（Emerscn）试剂： TnKe"TA|9 =XWi+') 甲液：2%4-氨基安替比林乙醇液 ( E0be. RQh4RUm 乙液：3%铁氰化钾水溶液，（或用0.9%4-氨基安替比林和5.4%铁氰化钾水溶液）。 UqNO JC j"8GB 4重氮化试剂：本试剂系由对硝基苯胺和亚硝酸钠在强酸下经重氮化作用而成，由于重氮盐不稳定很易分解，所本试剂应临用时配制。 pM' k=d =WRPGM*9 甲液：对硝基苯胺0.35g，溶于浓盐酸5ml，加水至50ml。 cl;%4$9 E0Uj&g

55、t;9+ 乙液：亚硝酸钠5g，加水至50ml jMZ>l.v :g=n&x 应用时取甲、乙液等量在冰水浴中混合后，方可使用。 +YdfrF Ow&4F; 5Gibb试剂： RV7l=G9tq EanGDLz8 甲液：0.5%2，6-二氯苯醌-4氯亚胺的乙醇溶液。 vJ p yp_: RE 乙液：硼酸一氯化钾一氢氧化钾缓冲液（pH9.4）。 KR%DpQ&' -dZ7;n5&_ 注试剂配制法中：1.水是指蒸馏水；2.不指出溶剂的即为水溶液；3.醇指95%；4.试剂配制后应澄清，如不澄清可过滤。 (.K|l 9v8JaI3 （三）内酯、香豆素类 >7p?*&7; I_oJx 1异羟肟酸铁试剂 KL-$B*i !MOVvO 甲液：新鲜配制的1N羟胺盐酸盐（M=69.5）的甲醇液。 D PjTR RtwlPz<S 乙液：1.1N氢氧化钾（M=56.1）的甲醇液 M,7A|?O 1VxMx 丙液：三氯化铁溶于1%盐酸中的浓度为1%的溶液。 09eH .'k2%ILp 应用时甲、乙、丙三液体按次序滴加，或甲、乙两液混合滴加后再加丙液。 $hZb<Xz r&"D#)sy 24-氨基安替比林一铁氰化钾试剂（见二一（二）-3）。 MB06=N ?rOVey 3重氮化试剂：（见二