十六章-抗生素药物的分析

1、第十六章第十六章抗生素类药物分析抗生素类药物分析一、抗生素的定义及特点一、抗生素的定义及特点低化学纯度低化学纯度同系物多、异构体多、降解物多同系物多、异构体多、降解物多活性组分的变异性活性组分的变异性生产过程中条件的变生产过程中条件的变化化不稳定性不稳定性不稳定性结构不稳定性结构 是指是指“生物在其生命活动中产生的，能在生物在其生命活动中产生的，能在低微浓度下有选择地抑制或影响它种生物机低微浓度下有选择地抑制或影响它种生物机能的化学物质的总称能的化学物质的总称”抗生素的分类抗生素的分类内酰胺类抗生素四环素类抗生素氨基糖苷类抗生素大环内酯类抗生素多烯大环类抗生素制菌霉素、两性霉素多肽类抗生素放线

2、菌素、多黏菌素酰胺醇类抗生素氯霉素抗肿瘤类抗生素其他抗生素二、抗生素类药物的分类二、抗生素类药物的分类按化学结构分按化学结构分三、抗生素类药物的细菌耐药性三、抗生素类药物的细菌耐药性三、抗生素类药物的细菌耐药性三、抗生素类药物的细菌耐药性1、耐药性的种类固有耐药性：天然耐药性，由细菌染色体基因决定获得性耐药性：2、耐药的机制（1）产生灭活酶，使抗菌药失活 如-内酰胺酶（2）抗菌药物作用靶位改变（3）降低细菌外膜通透性（4）影响主动流出系统四、抗生素药物的质量分析四、抗生素药物的质量分析鉴别试验鉴别试验1、官能团的显色反应特殊基团的反应2、光谱法特征吸收3、色谱法保留行为4、生物学方法抗菌能力检

3、查检查1、影响产品稳定性的检查项目水份、酸碱度等2、控制有机和无机杂质的检查项目3、与临床安全性密切相关的检查项目异常毒性、热原等4、其他检查项目其他共存组分含量或效价测定含量或效价测定1、微生物检定法比浊法管碟法抑菌圈效价:是指每ml或每mg中含有某种抗生素有效成分的多少 U/mg是以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标来判断效价的一种方法方法灵敏度高、需用量少灵敏度高、需用量少适用范围广适用范围广纯品、不纯品、已知的和新的纯品、不纯品、已知的和新的可一次测定同类型抗生素的总效价可一次测定同类型抗生素的总效价无需分离纯化无需分离纯化与临床的应用要求一致与临床的应用要求一致操作繁琐、费时费力操

4、作繁琐、费时费力误差较大误差较大是结构复杂和多组分抗是结构复杂和多组分抗生素效价测定的首先方生素效价测定的首先方法法优点优点含量或效价测定含量或效价测定1、微生物检定法缺点缺点 2、物理化学法 HPLC LC-MS UV 容量法准确可靠、专属性高、操作简单、省时、样品用量少1、对结构已知或提纯的抗生素2、需要标准品对照仪器分析方法含量或效价测定含量或效价测定-内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸（6-APA）；青；青霉素类；霉素类；7-氨基头孢菌烷氨基头孢菌烷酸（酸（7-ACA）；头孢菌素类；头孢菌素类；一、结构及分类一、结构及分类NSCH3CH3COOHONHRO1234

5、567HHHNONHRO567SCOOHCH2R181234HH氢化噻嗪环氢化噻嗪环氢化噻唑环氢化噻唑环NH2CONSOHNCOOHCH3CH3HOCH2NONHSCH3COOHOCNH2CH2HO 理化性质理化性质1 1、酸性与溶解性、酸性与溶解性2 2、旋光性、旋光性3 3、紫外吸收特性、紫外吸收特性4 4、不稳定性、不稳定性NONHRO567SCOOHCH2R181234NSOHNCOOKCH3CH3OCCH2酸性酸性一、结构特点与性质一、结构特点与性质NaNa与碱金属与碱金属(Na(Na+ +、K K+ +) )成盐成盐 （一）羧基（一）羧基 易溶于水易溶于水 与有机碱与有机碱( (普

6、鲁卡因普鲁卡因) )成盐成盐 难溶于水难溶于水普鲁卡因普鲁卡因青霉素青霉素C2H52NCH2CH2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCCH2NH2NSO123456787654321NOS头孢菌素类头孢菌素类 C6 C7青霉素类青霉素类 C3 C5 C6 旋光性旋光性 NSO头孢菌素类头孢菌素类 母核有共轭体系母核有共轭体系 青霉素类青霉素类 母核无明显母核无明显UVUV 多数有苯环取代基多数有苯环取代基 NOS UVUV（四）（四）内酰胺环的不稳定性内酰胺环的不稳定性 水溶液水溶液 不稳定不稳定 干燥纯净干燥纯净 稳定稳定 不稳定不稳定性因素性因素四元环张力大四元环张力大 酰胺键易水解酰

7、胺键易水解 含水量含水量 纯度纯度 青霉素类青霉素类 某些氧化剂某些氧化剂酸、碱、青霉素酶酸、碱、青霉素酶（某些金属离子）（某些金属离子） （温度）（温度）降解降解失效失效（四）（四）内酰胺环内酰胺环 NSCH3CH3COOHONHRO1234567HHNSCH3CH3COOHONHRO1234567HOH青青 霉霉 素素 酶酶青青 霉霉 噻噻 唑唑 酸酸强强 酸酸 性性 环环 境境NSCH3CH3COOH1234HNRHOOCN酸酸 性性 加加 热热CH2CONHCH2CHOCCH3HSCH3CHCOOHH2N+弱弱 酸酸 性性青青 霉霉 醛醛青青 霉霉 胺胺ONORNHCH3CH3HSCO

8、OH青青 霉霉 烯烯 酸酸NH2OH青青 霉霉 噻噻 唑唑 酸酸 酰酰 基基 羟羟 胺胺 酸酸HgCl2青青 霉霉 酸酸与含水量和纯度密切相与含水量和纯度密切相关关青霉素的降解途径青霉素的降解途径青霉素的降解产物青霉素的降解产物青霉噻唑酸青霉噻唑酸青霉素酶青霉素酶青霉酸青霉酸强酸性环境强酸性环境青霉烯酸青霉烯酸弱酸性环境弱酸性环境青霉醛青霉醛强酸性强酸性-加热加热青霉胺青霉胺强酸性强酸性-加热加热/青霉素酶青霉素酶-重金属重金属降解产物降解产物二、鉴别反应二、鉴别反应（一）显色反应（一）显色反应1、异羟肟酸铁反应、异羟肟酸铁反应NONHRO567SCOOHCH2R181234NaOHHNONH

9、RO567SCOONaCH2R11234NHOHFe3+HNONHRO567SCOONaCH2R11234FeNHOH2NOHHClC2H5OH（红、棕、褐）NH2CONSOHNCOOHCH3CH3CH22. 茚三酮茚三酮反应反应 -氨基氨基 -氨基氨基茚三酮茚三酮 蓝紫色蓝紫色烯醇式茚三酮酮式茚三酮缩合蓝紫色+H2OCNCH2RC=ORCHH2NCOOHOC=COCOCOHNH2CCOCOCOCOHCNCCOCOCOCOHCHRNCCOCOCO3. 双缩脲反应双缩脲反应 CONH（开环分解）（开环分解） - 内酰胺类内酰胺类碱性酒石酸铜碱性酒石酸铜紫红色紫红色2OHCONH2CuCOHNCC

10、H3COONaCH3SNHNCH3CH3COONaCSNOHOHOOCH2NH2CH2HH紫红色4. 与重氮苯磺酸反应与重氮苯磺酸反应橙黄色橙黄色重氮苯磺酸重氮苯磺酸 5 56 6OHHC（偶合）（偶合）酚羟基酚羟基头孢哌酮头孢哌酮1. K+、Na+的火焰反应的火焰反应（二）各种盐的反应（二）各种盐的反应 焰色焰色鲜黄色鲜黄色 + 醋酸氧铀锌醋酸氧铀锌黄黄 Na+ 焰色焰色紫色紫色 + 0.1%四苯硼钠四苯硼钠 白白 K+色谱法色谱法（三）（三）1、 TLC法法对照品对照法对照品对照法和斑点颜色和斑点颜色比较比较供试品供试品对照品对照品相同条件相同条件fR2、 HPLC法法Rt比较比较供试品供

11、试品对照品对照品相同条件相同条件光谱法光谱法（四）（四）1、 UV法法 样品、分解产物样品、分解产物nmHA339苯唑青霉烯酸苯唑青霉素Cu2+minmax,光谱图头孢氨苄头孢氨苄 max = 262nm青霉素青霉素V钠钠 A280nm/A264nm = 1.301.502、IR法法3180cm-1 N-H内酰胺内酰胺 C=O1780cm-13470cm-1 O-H1690cm-1仲酰胺仲酰胺 C=O1250cm-1 C-O以阿莫西林为例以阿莫西林为例三、杂质检查三、杂质检查 药物药物 检查项目检查项目 检查方法检查方法 头孢他啶头孢他啶 聚合物聚合物 HPLCHPLC法法 头孢曲松钠头孢曲松

12、钠 头孢哌酮钠头孢哌酮钠 头孢噻肟钠头孢噻肟钠 头孢呋辛酯头孢呋辛酯 有关物质和异构体有关物质和异构体 HPLCHPLC法法 头孢氨苄头孢氨苄 有关物质有关物质 反相反相TLCTLC法法 青霉素钾（钠）青霉素钾（钠） 吸收度吸收度 紫外分光光度法紫外分光光度法 1.1.头孢他啶头孢他啶聚合物聚合物的测定的测定 分子排阻色谱法分子排阻色谱法 固定相：葡聚糖凝胶固定相：葡聚糖凝胶G-10G-10 流动相流动相A A：3.5%3.5%硫酸铵的硫酸铵的0.01mol/L0.01mol/L磷酸盐缓冲磷酸盐缓冲液液 流动相流动相B B：0.01%0.01%十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠 对照品溶液：头孢他啶

13、对照品对照品溶液：头孢他啶对照品 100100g/mlg/ml 1 1）系统适用性试验：理论塔板数和拖尾因）系统适用性试验：理论塔板数和拖尾因子用子用1mg/ml1mg/ml蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖20002000、流动相、流动相A A测定；重测定；重复性用对照品溶液、流动相复性用对照品溶液、流动相B B测定。测定。 N N不低于不低于900900，拖尾因子，拖尾因子0.0.751.5.5，峰面积的，峰面积的RSDRSD应小于应小于5.0%5.0%2 2）测定方法）测定方法 进样供试液，用流动相进样供试液，用流动相A A；进样对照液，用；进样对照液，用流动相流动相B B。以外标法计算，含头孢他啶聚

14、合物以。以外标法计算，含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过头孢他啶计不得超过0.3%0.3%。异构体异构体异构体A异构体B3-异构体E异构体控制比例有关物质3 3）异构体：）异构体： 相对保留时间相对保留时间 1-1-被测物被测物 2-2-标准物标准物异构体异构体 相对保留时间相对保留时间 判断判断B B异构体异构体 0.85 0.85 供试液谱图中供试液谱图中A A异构体的峰面积异构体的峰面积A A异构体异构体 1.0 1.0 与与A A、B B异构体峰面积和之比应异构体峰面积和之比应 为为0.480.480.550.55。2112RRttr异构体异构体A A异构体异构体B B头孢呋辛酸头孢

15、呋辛酸3-异构体异构体 E E异构体异构体 E E异构体异构体 有关物质有关物质高低浓度自身对照法（高低浓度自身对照法（1%）有关物质 相对保留时间 判断3-异构体 1.2 不得大于对照液主峰面积之和的1.5倍（1.5%）E异构体 1.7和2.1 不得大于对照液主峰面积之和（1.0%）其他杂质 不得大于对照液主峰面积之和的1/2（0.5%）所有杂质 不得大于对照液主峰面积之和的3倍（3.0%）3.3.青霉素钠（钾）的青霉素钠（钾）的吸收度吸收度检查：检查： 供试液供试液 1.80mg/ml1.80mg/ml， 结果判断：结果判断：A A280280不得大于不得大于0.100.10，在264nm

16、处有最大吸收，吸光度应为0.80-0.88.（一）高效液相色谱法（一）高效液相色谱法原理：利用青霉素类抗生素在一定条件下在反相原理：利用青霉素类抗生素在一定条件下在反相硅胶上的保留行为的不同而实现高效分离，并与硅胶上的保留行为的不同而实现高效分离，并与标准品相对照，而对其进行定量的一种方法。标准品相对照，而对其进行定量的一种方法。优化色谱分析条件优化色谱分析条件（1 1）Column Column -CN ODS C-CN ODS C1818 C C8 8 -Ben -Ben（2 2）mobile phase/flow ratemobile phase/flow rate（3 3）column

17、 temperature column temperature （4 4）detection wavelengthdetection wavelength（5 5）workstation sample preparationworkstation sample preparation四、含量测定四、含量测定-容量法和仪器分析法容量法和仪器分析法实验注意事项实验注意事项（1 1）色谱峰要达到较好的分离基线分离）色谱峰要达到较好的分离基线分离(base separation)(base separation)（2 2）需要标准品对照，用外标法定量）需要标准品对照，用外标法定量（3 3）可同时测定多

18、个组分的含量）可同时测定多个组分的含量（4 4）需要排除制剂中辅料等杂质对测定的干扰）需要排除制剂中辅料等杂质对测定的干扰（二）生物样本中（二）生物样本中- -内酰胺类抗生素的分析内酰胺类抗生素的分析血浆血浆尿样尿样唾液唾液胆汁胆汁生物样生物样本本色谱柱色谱柱：Hypersil ODS C18 (200 mm4.6 mm, I.D. 5m)样品制备样品制备：取血浆取血浆200L，加入内标，加入内标5L，再加入，再加入HCLO4，窝旋提取窝旋提取Internal standard IS第三节第三节 氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素苷苷苷元苷元糖糖缩合缩合 氨基糖苷氨基糖苷苷元苷元氨基糖氨基糖缩合

19、缩合 链霉素链霉素 双氢链霉素双氢链霉素新霉素新霉素 卡那霉素卡那霉素庆大霉素庆大霉素 巴龙霉素巴龙霉素链霉素：链霉素：链霉胍链霉胍链霉糖链霉糖N-甲基甲基-L-葡萄糖胺葡萄糖胺OOOOHOOHOHCH3CHOOHCH2OHOHOHHNCH3HNHNCCNHNH2NHH2N* * 糖糖 苷元苷元绛红糖胺绛红糖胺 + 脱氧链霉胺脱氧链霉胺 + 加洛糖胺加洛糖胺 糖糖 一一、结构与性质结构与性质多与硫酸成盐多与硫酸成盐链霉素链霉素 3 3个个庆大霉素庆大霉素 5 5个个碱性中心碱性中心碱性碱性（一）（一）水溶性水溶性溶解性溶解性（二）（二）链霉素链霉素 pH57.5庆大霉素庆大霉素 pH212 稳

20、定稳定稳定性稳定性（四四）UV（三三）链霉素的链霉胍在链霉素的链霉胍在230nm有有UV吸收吸收庆大霉素、奈替米星等无庆大霉素、奈替米星等无UV吸收吸收NH CNHNH2HOOHOHNHCH2NNHOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHCH3坂口反应坂口反应N-甲基葡萄甲基葡萄糖胺反应糖胺反应麦芽酚反应麦芽酚反应二二、 鉴别鉴别 茚三酮反应茚三酮反应（一一）蓝紫色蓝紫色庆大霉素庆大霉素链霉素链霉素茚三酮茚三酮羟基胺类和羟基胺类和-氨基酸性质氨基酸性质OOOCNH2H+OOHNOO蓝紫色（二）Molisch试验具有五碳糖或六碳糖结构H+糠 醛羟甲基糠醛-萘酚红紫色蒽酮蓝紫色OHOH2CC

21、HOOHOHOHOHOH2CCH红紫色羟甲基糠醛OHOH2CCHOOOCH2OOCH糠醛与蒽酮的呈色原理羟甲基糠醛蓝紫色（三） N-甲基葡萄糖胺反应甲基葡萄糖胺N链霉素水解乙酰丙酮 OH-吡咯衍生物（I）对二甲氨基苯甲醛H+樱桃红色（II)（Elson-Morgan反应）新霉素巴龙霉素NHCH3NHNHNH C NH2HOOHOHNHCH2NOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOH(缩合)323COCHCOCHCH OHN(CHOH)3CH3COCH3CH3HOCH2樱桃红色对二甲氨基苯甲醛H+N(CHOH)3CH3COCH3CH3HOCH2NCH3COCH3CH3NCOCH3CH3CH3C

22、HNCH3CH3 （4）麦芽酚反应）麦芽酚反应链霉素的特征反应链霉素的特征反应 链霉糖链霉糖链霉素链霉素 OH麦芽酚麦芽酚紫红色紫红色 3FeH+分子重排麦芽酚麦芽酚链霉素特有反应链霉素特有反应橙红羟基喹啉8链霉胍链霉素次溴酸钠OH（或-萘酚）NOH8-羟基喹啉（五）（五）坂口反应坂口反应-萘酚OHBrO-NOHNOOBr8羟基喹啉 链霉胍 （六）硫酸盐反应白白 BaSOSOBaH+盐酸or硝酸不溶（七）色谱法：1.TLC多以硅胶为薄层板，三氯甲烷-甲醇-浓氨水为展开剂，茚三酮或碘蒸汽为显色剂。2.HPLC供试品溶液和对照品溶液的色谱图进行鉴别（八） UV法链霉素在230nm处有紫外吸收。庆大

23、霉素、奈替米星等无紫外吸收。（九） IR法特殊杂质的检查及组分分析特殊杂质的检查及组分分析（一）链霉素中链霉素（一）链霉素中链霉素B1.来源来源发酵过程中产生的甘露糖链霉素发酵过程中产生的甘露糖链霉素2.活性活性链霉素的链霉素的20%-25%3.检查方法检查方法TLC/水解，甘露糖为对照水解，甘露糖为对照3.色谱条件色谱条件薄层板：硅胶薄层板：硅胶G 显色剂：显色剂：1,3萘二酚萘二酚-硫酸硫酸 1010.pH吲哚衍生物吲哚衍生物巯基醋酸巯基醋酸邻苯二醛邻苯二醛氨基氨基max = 330nm衍生化原理衍生化原理 1.1.(二）庆大霉素中组分二）庆大霉素中组分C的检查衍生化后的检查衍生化后HPL

24、C色谱柱、流动色谱柱、流动相、检测波长、衍生化条件的摸索。相、检测波长、衍生化条件的摸索。 组分组分C的毒副作用和耐药性与庆大霉素有差异，导致产品的毒副作用和耐药性与庆大霉素有差异，导致产品的效价和临床疗效的效价和临床疗效1-烷基硫代烷基硫代-2-烷基烷基异吲哚衍生物异吲哚衍生物RNH2+HSCH2COOHOH-CHOCHONRSCH2COOHRPHPLC方法方法 2.规定规定 C1 2550% C1a 1540% C2a +C2 2050%计算计算 3.%100%2211CCCCiiAAAAAAaa峰面积归一化法峰面积归一化法四四、 含量测定含量测定微生物检定法微生物检定法 比浊法、管碟法H

25、PLC法法 无吸收不能直接用、荧光检测器无吸收不能直接用、荧光检测器柱前、后衍生化检测器柱前、后衍生化检测器电化学检测器电化学检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器第四部分：四环素类抗生素第四部分：四环素类抗生素RRRRHN(CH3)2OHCONH2OOHOOHOHABCD410Trtracyclines TC 理化特性理化特性（1）酸碱两性）酸碱两性C4（二甲氨基二甲氨基）、）、C10（酚羟基酚羟基）（2）旋光性）旋光性含有手性中心含有手性中心（一般为左旋）（一般为左旋）（3）紫外吸收特性具有）紫外吸收特性具有共轭双键共轭双键体系（吸收波长体系（吸收波长为长波方向）为长波方向）（4）与金属离

26、子的配位化合物反应）与金属离子的配位化合物反应酚羟基和烯醇酚羟基和烯醇基基（5）不稳定性对各种外界条件，包括氧化剂、酸、）不稳定性对各种外界条件，包括氧化剂、酸、碱，易形成碱，易形成差向、脱水和异四环素差向、脱水和异四环素，颜色加深，颜色加深RRRRHN(CH3)2OHCONH2OOHOOHOHABCD410RRRRHN(CH3)2OHCONH2OOHOOHOHABCD410弱酸性环境弱酸性环境ETC差向四环素差向四环素RH3CO HR HN (C H3)2O HC O N H2OO HOO HO HABCD410RR HN (C H3)2O HC O N H2OOO HO HO HABCD4

27、10C H366强酸性环境强酸性环境ATC脱水四环素脱水四环素RH3COHRHN(CH3)2OHCONH2OOHOOHOHABCD410RRHN(CH3)2OHCONH2OOHOOHOHABCD410CH366O碱性环境碱性环境EATC异四环素异四环素差向脱水四环素差向脱水四环素二二、 鉴别试验鉴别试验 浓浓H H2 2SOSO4 4反应反应（一一）黄色黄色朱红色朱红色黄色黄色兰色兰色黄色黄色紫红色紫红色黄色黄色盐酸多西环素盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸金霉素盐酸四环素盐酸四环素 SOH盐酸美他环素盐酸美他环素橙红色橙红色FeCl3反应反应（二二）褐色褐色橙褐色橙褐色深褐色深褐

28、色红棕色红棕色盐酸多西环素盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸金霉素盐酸四环素盐酸四环素3 3FeClTLCTLC法法（三三）盐酸土霉素的鉴别盐酸土霉素的鉴别 HPLCHPLC法法（五五）EDTAEDTA 克服痕量金属造成的克服痕量金属造成的 拖尾现象拖尾现象比较保留时间比较保留时间三三、 特殊杂质检查特殊杂质检查 4-4-差向四环素（差向四环素（ETCETC） 脱水四环素脱水四环素（ATCATC） 差向脱水四环素差向脱水四环素（EATCEATC） 盐酸金霉素盐酸金霉素（CTCCTC） 有关物质有关物质（一一）HPLCHPLC法（法（20002000版）版）盐酸四环素盐酸四环素四环素

29、有关物质四环素有关物质TLCTLC图图I. 供试液供试液( 5 mg/ml)II. ETC( 0.2 mg/ml)III. ATC( 0.025 mg/ml)IV. EATC ( 0.025 mg/ml)V. CTC ( 0.1 mg/ml)VI. 混合液混合液40.50.52吸收度吸收度（二）（二）nmmax3553556868 、盐酸四环素盐酸四环素杂质吸收度杂质吸收度 取供试品配成每取供试品配成每10mg/ml10mg/ml的溶液至的溶液至4cm4cm的吸收池中，在的吸收池中，在530nm530nm处测定，其吸处测定，其吸收度不得超过收度不得超过0.120.12。应严格控制温度和时间应严格控制温度和时间四四、 含量测定含量测定HPLCHPLC法法 盐酸四环素的测定盐酸四环素的测定 系统适用性试验：盐酸四环素、有关系统适用性试验：盐酸四环素、有关 物质及物质及ATCATC峰间的峰间的 分离度均应符合要分离度均应符合要 求。求。 定量方法：外标法以峰面积计定量方法：外标法以