抗菌肽cecropin-Xm在大肠埃希菌中的串联表达与抑瘤作用

1、抗菌肽cecropin-Xm在大肠埃希菌中的串联表达与抑瘤作用                     作者：沈益 劳学刚 耿伟 张洪祖 徐贤秀【摘要】   在TNF基因3端连接抗菌肽cecropin-Xm基因多拷贝串联体，与温度诱导的表达载体pRCs组成表达载体pRCs-TNF-(cecropin-Xm)n(n=1，2，3)，并在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达融合蛋白TNF-(

2、cecropin-Xm)n(n=1，2，3)。SDS-PAGE结果显示，在同样表达条件下 应用 BL21(DE3)/pRCs-TNF-(cecropin-Xm)2表达系统可获得比BL21(DE3)/pRCs-TNF-cecropin-Xm系统多出一倍的目的物cecropin-Xm。融合蛋白经CNBr切割后用CM52纤维素柱分离纯化得到纯度大于95%的具有抑菌活性的抗菌肽cecropin-Xm，体外MTT抑瘤实验表明cecropin-Xm具有广谱杀灭肿瘤细胞的作用并且对正常细胞影响极小。 【关键词】   抗菌肽； Cecropin-Xm； 基因串联； 抑瘤作用  &

3、#160;  抗菌肽cecropins是瑞典 科学 家Boman于1980年首先从惜古比天蚕中发现的1，后来在其它蚕类、昆虫和哺乳动物2，3中发现了各种类型的抗菌肽，其中包括多种cecropin类的抗菌肽。抗菌肽cecropins一般由3339个氨基酸组成，具有高度的同源性，对革兰阳性菌和阴性菌都有杀伤力，对正常真核细胞没有影响4。有实验表明，抗菌肽的作用对象和作用机制各异，其中某些抗菌肽可以通过引起肿瘤细胞凋亡5和激活经典的补体途径等来杀伤肿瘤细胞6。    为了更好的研究cecropin类的抗菌肽，本实验室参照抗菌肽CMIV7的氨基酸序列，用化学方法

4、合成了编码抗菌肽CMIV突变体cecropin-X的cDNA8，并在大肠埃希菌中进行表达研究9。为了获得易于后期纯化且稳定的表达系统，在pRC系统10中完成了抗菌肽cecropin-X基因与TNF(天然型肿瘤坏死因子)的融合表达11。为了从源头上提高抗菌肽的产量，首先利用PCR方法在cecropin-X基因末端加入了甲硫氨酸的密码子， 得到了cecropin-Xm基因； 再将cecropin-Xm基因串联在TNF基因的3-端。在此基础上，完成了TNF-(cecropin-Xm)n(n=1，2，3)的串联表达，纯化得到了与cecropin-X具有同样抑菌活力的高纯度的cecropin-Xm。在体

5、外实验中，cecropin-Xm对多种人源肿瘤细胞表现出明显的抑制作用。    1  材料和方法    1.1  材料    1.2  方法    (1)取质粒pRC用EcoRI和PstI酶切后回收；(2)合成互补的寡核苷酸链  5-AATTCGTCGACGGATCCCTGCA-3和5-GGGATCCGTCGACG-3，加入T4 DNA连接缓冲液，85加热5min后 自然 冷却至室温；(3)将(1)和(2)的产物连接后转化入E.coli

6、 TOP10感受态细胞中，涂布LB(含氨苄西林100g/ml，如无特殊说明以下同)平板，30培养过夜；(4)对随机挑选的5个克隆进行测序鉴定。    (1)取本实验室构建的质粒pRC-TNF-(cecropin-X)11，用EcoRI、SalI酶切并回收TNF片段；(2)质粒pRC-TNF-(cecropin-X)为模板，寡核苷酸链，5-CGGTCGACATGAGATGGAAAATC-3为5端引物，分别以寡核苷酸链，5-CCGGATCCACTACATGTTGATGGTAGCAGC-3和，5-CGGTCGACCATGTTGATGGTAGCAGC-3为3端引物，利用P

7、CR扩增11获得末端加入甲硫氨酸密码子(ATG)和终止密码子(TAG)的cecropin-Xm基因片段Xm-a，以及末端仅含甲硫氨酸密码子(ATG)的cecropin-Xm基因片段Xm-b，回收相应片段；(3)分别用EcoRI和BamHI酶切质粒pRCs；SalI和BamHI酶切Xm-a；SalI酶切Xm-b，回收pRCs、Xm-a和Xm-b；(4)将上述(1)和(3)产物连接后转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂布LB平板，30培养过夜；(5)挑选单克隆后提取质粒，用EcoRI和PstI酶切后行1%琼脂糖电泳检查。将有特异性片段的克隆进行测序鉴定。  &

8、#160; 细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组A均数   对照组A均数)×100%    2  结果    2.1  抗菌肽cecropin-Xm基因与表达载体pRCs的获得及重组质粒pRCs-TNF-(cecropin-Xm)n(n=1，2，3)的构建    (1)将质粒pRC-TNF-(cecropin-X)11用EcoRI、SalI完全酶切，回收TNF片段(490bp)，即得到含起始密码子但不含终止密码子的两端分别带EcoRI、SalI酶切位点的TN

9、F片段。将此片段与上述得到的载体pRCs(经EcoRI、SalI酶切后回收)连接即得到质粒pRCs-TNF(3945bp)。    2.2  重组蛋白的表达    含不同cecropin-X基因数的重组质粒pRCs-TNF-(cecropin-Xm)n(n=1，2，3)的大肠埃希菌经温度诱导表达。SDS-PAGE检测结果(Fig.3)表明，当n    pRC-T-X: pRC-TNF-cecropin-X;  pRCs-T: pRCs-TNF;    pR

10、Cs-T-Xm2: pRCs-TNF-(cecropin-Xm)2    Fig.1    Construction of pRCs-TNF-(cecropin-Xm)2    M: SE Perfect 100bp DNA ladder;  0: pRCs;    13: pRCs-TNF-(cecropin-Xm)n(n=1,2,3)    Fig.2    Electrophoresis of pRC

11、s and pRCs-TNF-    (cecropin Xm)n (n=1,2,3) cleaved with    restriction enzymes EcoRI 和PstI    值为1，2，3时，诱导表达的融合蛋白的分子量相应为21000、26000和31000ku左右(Fig.3中分别用黑色箭头表示)，Fig.3结果显示含有2个cecropin-Xm基因的重组质粒融合蛋白表达量比只有单个基因的略高，但含有3个cecropin-Xm基因的重组质粒融合蛋白表达量则明显减少。  

12、;  2.3  Cecropin-Xm的纯度鉴定和抑菌活性比较    46: BL21(DE3)/pRCs-TNF-(cecropin-Xm)n (n=1,2,3)    Fig.3    Expression of TNF-(cecropin-Xm)n (n=1,2,3)    in E.coli BL21(DE3)    3800ku，用RP-HPLC检测纯度可达95%以上。    2.4&#

13、160; Cecropin-Xm的抑瘤活性    Cecropin-Xm纯化样品检测了对肿瘤细胞HepG2、QGY-7703、Hela、BGC-823、LOVO、U937、HL60和正常肝细胞HL-7702的IC50分别为100、6.30、10、160、15、10和>400gmol/L，结果表明cecropin-Xm对我们目前所研究的肿瘤细胞都表现出不同程度的杀伤力，尤其对QGY-7703、BGC-823、U937和HL60细胞的活性作用更明显，而对正常肝细胞HL-7702不敏感。这就为将cecropin-Xm开发成为一种安全有效的抗肿瘤药物提供了初步的实验

14、。    3  讨论    因为抗菌肽不仅杀菌还有抗病毒和抗肿瘤细胞而不破坏人体正常细胞等作用，因此正在 农业 、畜牧业、医药及食品 工业 中显示出越来越广阔的 应用 前景。通常研制和应用的抗菌肽均是从昆虫体液等天然物质中提取，来源途径广泛，但含量极低，提取步骤繁杂，很难获得大量高纯度的抗菌肽。随着分子生物学技术的广泛应用，人们开始采用酵母体系及昆虫或昆虫细胞体系进行基因表达。从工业化生产的角度考虑，在基因工程表达体系中，具有成本低、周期短、表达水平高、易于操作等优点的大肠埃希菌最理想。因此，相关研究单位对在大肠埃希菌中表达

15、抗菌肽进行了各种尝试。本小组在完成了cecropin-X基因的克隆表达后，为了减少融合表达引起的目的蛋白的低含量，从源头上提高目的蛋白的收率，采用了构建多拷贝串联体的方法，以期获得更高表达量的目的蛋白。结果显示只有2个cecropin-Xm基因串联的重组质粒融合蛋白表达含量比只有单个cecropin-Xm基因的略高，含有3个cecropin-Xm基因串联的重组质粒融合蛋白含量则明显减少。我们还尝试了4个cecropin-Xm基因串联的重组质粒，但在SDS-PAGE检测时基本无特异性蛋白条带的出现。抗菌肽本身所含的丰富的正电荷可能是TNF-多个(cecropin-Xm)基因串联(当n3时)融合蛋

16、白低水平表达的主要原因13。Cecropin-Xm是带高度正电荷的肽，在宿主中表达时，n值越大它和核酸的结合机会越大，抑制了转录和翻译，最终导致低水平表达。因此，进一步的 工作 是寻找一种合适的方法消除这些正电荷的影响，如融合一段酸性肽使之以中性前体形式表达等。    为了保证纯化过程中串联体分离效率，我们仍采用CNBr切割，在串联体间引入甲硫氨酸密码子(ATG)。有 文献 报道14，抗菌肽末端的甲硫氨酸经CNBr作用后转变成高丝氨酸(homoserine)，但不影响抗菌肽的生物活性。本实验证明cecropin-Xm与cecropin-X的抗大肠埃希菌E.coli

17、 K12D31活性基本相同。本研究结果还表明cecropin-Xm对多种人源肿瘤细胞有较明显的不同程度的杀伤作用，但对正常人胚肝细胞影响极小，进一步提示抗菌肽cecropin-Xm可能作为一种广谱的低毒副作用的抗肿瘤药物应用于 临床 。【 参考 文献】   1 St EI ner H, Hultmark D, Engstrom A, et al. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity J. Nature,1981,292:246.2 Boman H G. H

18、ultmark D Cell-free immunity in insects J. Annu Rev Microbiol,1987,41:103.3 Lee J Y, Boman I A, Sun C, et al. Antibacterial peptides from pig intestine: Isolation of a mammalian cecropin J. Proc Natl Acad Sci,1989,86:9159.4 Boman H G, Wade D, Boman I A, et al. Antibacterial and antimalarial properti

19、es of peptides that are cecropin-melittin hybrids J. FEBS Lett,1989,259:103.5 Gamen S, Hanson D A, Kaspar A, et al. Granulysin-induced apoptosis I. Involvement of at least two distinct pathways J. J Immunol,1998,161:1758.6 Chen J G, Xu X M, Underhill C B, et al. Tachyplesin activates the classic complement pathway to kill tumor cells J. Can Res,2005,65(11):4614.7 屈贤铭，吴克佐，邱雪贞，等. 经聚肌胞苷酸诱导家蚕蛹血淋巴中六种抗菌肽的分离与鉴定J. 生物化学与生物物 理学 报，1986，18(3)：284.8 谢维，邱奇峰，陈江宁，等. 中国 家蚕抗菌肽CMIV基因的化学合成与克隆J. 南京大学学报( 自然 科学 版)，1996，32(3)：474.9 谢维，窦非，吴海宏，等. 抗菌肽CMIV突变体基因在E.coli中融合表达的研究J. 中国科学C辑，1997，27(3)：278.10 陈建军，孙苗，陈常庆，等.