拟南芥基因克隆的策略与途径

1、1 / 13拟南芥基因克隆的策略与途径拟南芥(Arabidopsis thaliana)是一种模式植物，具有基因组小(125 Mbp)、生长周期短等特点，而且基因组测序差不多完成( The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000)。同时，拟南芥属十字花科(Cruciferae )，具有高等植物的一般特点，拟 南芥研究中所取得成果专门容易用于其它高等植物包括农作物 的研究，产生重大的经济效益，特不是十字花科中还有许多重要 的经济作物，与人类的生产生活紧密相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。基因(gene)是遗传物质的最差不多单位,

2、也是所有生命活动的基 础。不论要揭示某个基因的功能，依旧要改变某个基因的功能，都必须首先将所要研究的基因克隆出来。 特定基因的克隆是整个 基因工程或分子生物学的起点。 本文就基因克隆的几种常用方法 介绍如下。1、图位克隆Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposedby Alan Coulson of the Universityof Cambridge in1986, Gene isolated by this method is based on fun cti onal genes inthe gen

3、ome has a relatively stable loci, i n theuse of genetic linkage analysis abnormalities ofor chromosomal2 / 13separate groups will queue into the chromosome of a specific location,By constructing high-density molecular linkage map, to find molecularmarkers tightly linked with the aimed gene, continue

4、d to narrow thecandidate region and then clone the gene and to clarify its functionand biochemical mechanisms. 图位克隆( map-based clonig )又称定位克隆( positoinal cloning )，1986 年首先由剑桥大学的 Alan Coulson提出。用 该方法分离基因是依照功能基因在基因组中都有相对较稳定的 基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫 到染色体的 1 个具体位置的基础上， 通过构建高密度的分子连锁 图，找到与目的基因紧密连锁的分

5、子标记， 不断缩小候选区域进 而克隆该基因，并阐明其功能和生化机制。 用该方法分离基因是依照目的基因在染色体上的位置进行的， 无 需预先明白基因的 DNA 序列，也无需预先明白其表达产物的有关 信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定 突变表型的遗传基础。 近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完3 / 13成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力差不多大大减少了（图1 ）。MiAlUif-eerfDINAandvlafibli?mark-BTDuild phynK.ral mnip (VAG& orcofimhdsSiDavaFop mnk

6、orTrom YACa Or cCKOrrwdENO ONAEguONfi! kr mxl出gvre a variableClEunc and匚omplomantalhen cfenoo Beqtrenclmgi目前完成整个拟南芥的图位克隆过程大约需要一年时刻。在那个过程中，我们从筛选突变体开始，逐渐找到和表型相关的基因。这和反向遗传学（reverse genetics ）的方法正好相反。图 位克隆能实现， 关键在于全基因组测序打算的完成和各种分子标 记的发觉。这些数据被储存在专门的数据库中（表 1）（ Lukowitz等，2000 ）。表 1 拟南芥网络资源1995Total effort:

7、a to h pe raon -yeairfiKey岩p甘inmap-baeddoningiprocsss2002Total曰n口rt:MHperson-yearloirwlJirri rTwitfwiulrmarkar Is -availLiblHFhy&icaJmap-nxin-tsiChoose martwira from Crecxidatabasal-dfrnl ify rmniclicinlA IrofnC-ai-D BfcsqgiiQd!OeaQirt penprirnd-rs ironnCO4TJ, ItiEs-n丹!科ijqnc专4 / 13网站网址Supplemental

8、material for thispaper/methods/ppsuppl.htmlNottingham Stock Centre（U.K.）http:/nasc.nott.ac.uk/Recombinant Inbred maphttp:/nasc.nott.ac.uk/new_ri_map.htmlOhio Stock Center （ U.S.A.）/aims/TAIR database* ， homepageRecombinant

9、Inbred map（mirror site ）/cgi-bin/maps/RiintromapCAPS markers/aboutcaps.htmlSequence table/cgi-bin/maps/Seqtable.plSNP collection/SNPs.htmlCEREON collection ofpolymorphisms/cer

10、eonSSLP markers/SSLP_info/SSLP.htmlTIGR, genome annotations/tdb/athl/htmls/index.htmlDatabase of Ler sequences/tdb/atgenome/Ler.htmlKasuza DNA Researchnstitute ， genomeannotationshttp:/www.kazusa.or.jp/kaos/MIPS genome annotationshttp:/we

11、bsvr.mips.biochem.mpg.de/proj/thal/SINS database of transposonnsertionshttp:/www.jic.bbsrc.ac.uk/sainsbury-lab/jonathan-jones/jjhome.htm*注：The Arabidopsis Information Resource（ TAIR）在拟南芥中的图位克隆，在专门大程度上得益于对 Col-0 生态型测序的完成，因为它是在研究拟南芥时最常用的生态型。 实现基因图位克隆的关键是筛选与目标基因连锁的分子标记。 实质上，分子标记是一个特异的 DNA 片段或能够检出的等位基因，

12、 对其有效地利用即可达到图位克隆基因之目的。迄今为止，已有几十种技术可用于分子标记的筛选（ Wang 等，2000）。其中最为 常用的是简单序列长度多态性（SSLPS 和单核苷酸多态性（SNPS5 / 13SSLP 是基于 PCR 勺分子标记，在拟南芥基因组中有较多分布，而且是共显性的，它的检测特不直接，然而我们需要设计引 物来检测假定的 SSLP 标记；对 SNPS 标记的检测也比较直接， 它 是拟南芥不同生态型之间基因组中的单个核苷酸的差不，这些差不的核苷酸通常位于非编码区域（Peters 等，2003 ）。最常见 的用于检测 SNPs 标记的方法要紧是剪切扩增多态性序列（CAPS，它也是

13、基于 PCF 的。另外，一种更为有效的方法衍生的 CAPS dCAPS （ Nam 等, 1989 ； Michaels 和 Amasino，1998）可把任何已知的点突变作为分子标记， 只要在 PCR 是引入不配对 的引物，使扩增的序列在一个生态型中具有限制性酶切位点，而在另一生态型中没有，以形成多态性。图位克隆法随着相关配套技术（序列数据库、分子标记等）的日渐成熟，许多拟南芥及一些农作物的基因已被成功的克隆（表 2）。表 2 用图位克隆方法得到的拟南芥及一些农作物的基因基因突变表型基因同源序列AB13脱落酸不敏感玉米转录子FID3降低亚油酸饱和度细菌去饱和酸酶AXR1生长素抗性泛素 N 端

14、活性酶ETR1乙烯抗性双因子调节子ABI1脱落酸不敏感钙调蛋白磷酸化酶DET1黄化损伤反应新核蛋白RPS2抗病新型富含亮氨酸的蛋白酶RPM1抗病激酶RSW1纤维素合成酶细胞色素 P450 家系ZLL调节中茎分生细胞胚胎发育蛋白PRT1抑制胞间蛋白降解操纵植物 N 端代谢Torn adol植株短化6 / 13IFL1正常的维管束间纤维分化受阻亮氨酸拉链蛋白ARA1树胶醛糖激酶活性丧失半乳糖激酶基因家族VTC2维生素 C 合成不足果蝇蛋白 CG3552 线虫蛋白 C10F3.4 （功能未知）AST种皮花青苷斑点花青苷生物合成途径中的二氢黄酮醇-4-还原酶本文拟对图位克隆的研究进展做一介绍，以期对植物遗传育种和分子生物学研究有所关心。2 图位克隆的一般过程因为有了拟南芥的基因组序列和高密度的遗传标记，图位克隆过程就变得相对直接。 图 2 例举了一种高效的拟南芥图位克隆 方法。从基于 Col-0 和 Ler遗传背景的突变体动身，我们有可能 在大约一年时刻内找出与那个突变相关的基因，这其中要紧耗时刻的是五个植物 （拟南芥） 的生长周期 （我们假定每个周期为两 个月） 。