实验性糖尿病肺形态学及氧自由基研究

1、    实验性糖尿病肺形态学及氧自由基研究        摘要目的：了解早期糖尿病肺形态学及氧化应激的变化。方法：应用体视学方法对四氧嘧啶诱导的糖尿病28 d大鼠肺进行定量研究、观察超微结构变化并测定血清和肺组织的超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。结果：糖尿病大鼠肺泡体密度和平均截线长度减少，肺泡壁体密度、肺泡表面积密度、肺泡数密度、肺泡面数密度和肺泡比表面增加。糖尿病大鼠型肺泡细胞粗面内质网扩张，其体密度、面密度、平均截面积和平均周长增加，而比表面减少。肺

2、上皮和毛细血管基底膜增厚。糖尿病大鼠血清SOD活性下降，MDA含量增加；肺组织MDA含量明显升高。结论:糖尿病早期大鼠肺已发生形态学变化且受到氧化应激的危害，提示肺脏是糖尿病损害的“靶器官”之一。主题词糖尿病，实验性； 肺；超氧化物歧化酶；丙二醛中分类号R563.1； R587.1文献标识码A文章编号1000-4718(2000)06-0552-05 Study of lung morphologic features and oxygen free radicals in experimental diabetic ratsSHEN Xing-ping, SHU Chang-da, ZHAN

3、G Zuo-cai, HE Jun(Department of Endocrinology, The Second College of Clinical Medicine,Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400010, China)AbstractAIM:To evaluate the changes of lung morphologic features and oxidative stress in experimental diabetic rats. METHODS: The pulmonary structu

4、re of alloxan-induced diabetic rats were quantitatively studied with stereological methods. Changes of ultrastructure, activities of superoxide dismutase (SOD) and contents of malondialdehyde(MDA) of diabetic lung and serum were observed. RESULTS: The volume proportion of alveolar air and mean linea

5、r intercept of diabetic rats decreased remarkably in comparison with controls while the volume proportion of alveolar wall, the surface density of alveolar, the numerical density of alveolic area, the numerical density of alveolar and specific surface of alveolar increased significantly. The major c

6、hange of the type II pneumocyte of diabetic rats was dilation of the rough endoplasmic reticulum (RER). The other findings in diabetic rats had included the presence of thickened alveolar epithelial, pulmonary capillary basal laminae and blood- air barrier, the volume density, the surface density, t

7、he mean profile area and the mean perimeter of RER in type pneumocyte of diabetic rats increased remarkably. And the specific surface of RER was significantly lower as compared with controls. SOD activity decreased and MDA content increased significantly in serum of diabetic rats as compared with th

8、e control group. SOD activity in the diabetic lung was not different from that of the control lung. However, the content of MDA obviously increased in diabetic lung. CONCLUSION: The morphologic features and oxidative stress in early diabetic rats are abnormal thus the lung should be considered as on

9、e of the “target organ”in diabetes mellitus.MeSH Diabetes mellitus, experimental; Lung; Superoxide dismutase; Malondialdehyde 目前认为，糖尿病(diabetes mellitus,DM)微血管病变和组织蛋白质非酶糖基化(nonenzymatic glycation)可能是其慢性并发症的主要发病机制。肺脏是一个具有丰富的微循环和结缔组织的器官。近年来关于DM对肺脏的损害尚未引起足够的重视。本文应用光镜及电镜方法对四氧嘧啶诱导的DM 28 d大鼠肺形态进行定性及体视学计量研

10、究，同时，测定血清和肺组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD) 活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量，旨在探讨DM肺病变的发病机制。材料和方法一、动物模型复制及取材雄性Wistar大鼠20只(本校实验动物中心提供),体重150180 g, 随机分为DM组与对照组。每组10只大鼠。DM组大鼠给予四氧嘧啶(本校临床学院人工细胞室提供)一次性腹腔内(按200 mg/kg体重)注射,对照组注射等量生理盐水。注射药物后第3 d测空腹血糖(邻甲苯胺法)13.90 mmol/L为DM模型成立。所有大鼠均自由饮水、进食。在DM模型成立28 d时，测空腹血糖

11、，其值仍13.90 mmol/L。DM组与对照组大鼠称重后,用1戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠,心腔内采血，速取肺脏。观察肺大体改变,称肺湿重,并计算肺系数(肺湿重(g)/体重(g)×100)。右肺制成匀浆，用于生化检查，左肺用于光镜和电镜观察。分离血清测定SOD活性、MDA含量。二、光镜观察左肺速取电镜标本后，剩余肺组织用10中性缓冲福尔马林固定4872 h,逐级脱水,常温石蜡包埋，用Reichert切片机切片(5 m厚切片)，每例肺进行连续切片，每隔5张等距离选取切片一张，共选5张切片,H.E染色，进行定性、定量观察。每张切片观察5个视野，即肺尖、肺底各两个固定视野,肺中部一个视野。

12、在OLYMPUS BH-2型显微镜下，放大400倍，用5 mm×5 mm网格目测微尺以点计数法测算下列参数，计算公式来自文献1。(一) 肺泡体密度(volume proportion of alveolar air, Vva)、肺泡管体密度(volume proportion of alveolar duct air, Vvd)、肺泡壁体密度(volume proportion of alveolar wall, Vvw)和传导气道体密度(volume proportion of conducting airway, Vvb)。计算公式如下：   

13、60;Pxi表示测试点落在第i幅像肺泡上的点数，Pci表示测试点落在第i幅像所定参照系上的点数，n表示像数。 (二) 肺泡平均截线长度(mean linear intercept, Lm)、肺泡表面积密度(surface density of alveoli, Sva)、肺泡数密度(numerical density of alveoli, Nv)、肺泡面数密度(numerical density on area of alveoli, NA)、肺泡比表面(specific surface of alveoli, Rsv(a)和肺泡管比表面(specific surface of alveol

14、ar duct air, Rsv(d)。计算公式如下：Lm:测试线穿过肺泡截面时，在截面内的平均长度。    PT、LT 分别为所用测试系统的测试点数和测试线长度，Ixi为测试线与肺泡界面的交点，Pci为包容空间的测试点数,M为放大倍数，单位为：m2m-3。    NX为测试肺泡截面数,PX为击中测试肺泡截面的点数,PC为参照系内的测试点数,为每个测试点所代表的面积,为形状常数（=1.55）, 单位为：个/m3。    NX为测试肺泡截面数,PC为参照系内的测试点数,为每个测

15、试点所代表的面积，单位为:个/m2。    单位为：m2m-3。 三、电镜观察每例左肺取3块肺组织，迅速以4戊二醛固定2 h，1四氧化锇后固定(4) 2 h，乙醇逐级脱水,环氧树脂618浸透、包埋。半薄切片0.51 m厚，甲苯胺蓝染色,光镜下定位。超薄切片500700 A°， 醋酸双氧铀和铅盐双重染色，在H-600型透射电镜下观察及照相。四、型肺泡细胞形态计量电镜下以10 000倍随机拍摄型肺泡细胞。其中对照组和DM组各30个细胞，每只动物24个。底片光学放大2倍,采用正方格测试系统，印有测试系统的底片与电镜底片叠印成照片，总放大倍数20 00

16、0倍。采用点计数法测算下列参数,计算公式来自文献2x)和平均周长(mean perimeter,x)。计算公式如下:    Pxi代表第i张照片上落在某结构范围内的测试点数,Pri代表同一张照片落在参照系截面内的测试点数。    Ixi代表第i张照片上膜截线与测试线的交叉点数，Pri代表同一张照片落在参照系截面内的测试点数，z等于小正方格边长的2倍，单位为: m-1。    a为一个测试点所代表的面积，Pxi代表第i张照片上落在某结构范围内的测试点数，Nxi代表在测试面积内有

17、某种结构截面数, 单位为m2。    z意义同前，Ix代表纵横两组平行线与曲线交叉点,单位为：m。(二) 线粒体体密度(Vv)、面密度(Sv)、比表面()和面数密度(numerical density on area, NA)。计算公式如下:    Nxi、Pri和a的意义同前，单位为：m-2。 （三）高尔基体体密度(Vv)、面密度(Sv)和比表面()。（四）板层体体密度(Vv)、面数密度(NAxx)。计算公式如下:    为大小分布系数,为形状系数,NA为面数密度,VV为体

18、密度,单位为：m-3结果一、DM大鼠血糖及肺系数变化DM28d大鼠血糖显著高于对照组。DM组大鼠肺湿重和肺系数分别与对照组比较，差异无显著(P0.05)。二、大体及光镜观察两组大鼠肺脏体积无差异，肺膜表面光滑，呈淡红色，但DM大鼠肺组织质地稍硬。光镜下，DM大鼠肺泡腔缩小，肺泡数量增多(1)。    Fig 1Diabetic rat lung (panel A). Alveolar size smaller than that of the control lung (panel B).Hematoxylin-eosin stain; Original

19、 megnification ×2001对照组与DM组大鼠肺形态变化三、肺泡形态计量DM大鼠Vva和Lm显著低于对照组(P0.05，P0.01)；Vvw、Sva、 Nv、NA及Rsv(a)显著高于对照组(P0.01)；Vvd、Vvb及Rsv(d)与对照组无显著差异(P0.05)(见表1)。Control group Diabetic groupVva0.590±0.055 0.530±0.029*Vvd 0.238±0.038 0.231±0.033 Vvw 0.148±0.041 0.233±0.052*Vvb 0.024

20、±0.006 0.024±0.006 Sva(m2m-3)28.420±4.13534.780±4.203*Nv(×10-4，m-3) 5.573±1.572 9.984±1.704*NA(×10-4，m-2)4.751±1.576 7.455±1.640*Rsv(a)(m2m-3)48.491±4.49665.123±4.440*Rsv(d)(m2m-3)29.186±3.489 31.498±3.675 Lm(m) 102.266±4.109

21、 85.279±4.597*     * P0.05，* P0.01， vs control group 四、电镜观察DM大鼠型肺泡细胞形态正常。型肺泡细胞游离面微绒毛正常，核园形，核周间隙轻度扩大，RER明显扩张，部分有脱颗粒， 扩张网池内颗粒物质电子密度低于周围胞质。部分高尔基体小囊轻度扩张，部分线粒体肿胀、扩张及空泡化。肺上皮细胞和毛细血管基底膜不同程度增厚。肺泡巨噬细胞表面伪足减少,毛细血管内皮细胞、间质细胞形态正常(2,3)。     Fig 2Both capillary and epithe

22、lial basal laminae of the lung of a diabetic rat are of variable thickness (TEM,×35 000)2DM大鼠肺基底膜增厚    Fig 3 Massively dilated rough endoplasmic reticulum(dRER)in a typepneumocyte from the lung of a diabetic rat(TEM, ×10 000)3DM大鼠型肺泡细胞RER明显扩张Control group Diabetic group

23、RERVv 0.014±0.0090.133±0.120*Sv(m-1) 0.253±0.1640.559±0.308*(m-1)20.807±10.614 12.543±9.204*<"02 (102 字节)" src="/med/cano/201003/20100309191804874" 11 19>x(m2) 1 148±620 26 459±8 458*<"03 (100 字节)" src="/med/cano/201

24、003/20100309191805595" 11 17>x(m) 3.839±1.467 9.671±6.100*MitochondriaVv 0.123±0.052 0.117±0.035Sv(m-1) 0.994±0.306 0.852±0.338(m-1) 9.401±2.806 8.480±1.520NA(×10-5,m-2) 5.149±1.1745.068±1.423Golg's complexVv 0.017±0.023 0.012&#

25、177;0.009Sv(m-1) 0.373±0.1970.236±0.160*(m-1)25.977±8.649 20.064±9.018*Lamellar bodyVv 0.139±0.054 0.110±0.070NA(×10-5,m-2) 5.670±1.2164.643±1.865Nv(×10-7,m-3)8.289±3.2396.944±2.293<"02 (102 字节)" src="/med/cano/201003/2010

26、0309191804874" 11 19>x(m2) 4 608±1 741 4 523±1 625<"03 (100 字节)" src="/med/cano/201003/20100309191805595" 11 17>x(m) 19.014±8.408 14.942±8.731     * P0.05, * P0.01, vs control group 五、型肺泡细胞形态计量DM大鼠型肺泡细胞RER的Vv、Sv、x、x均显著大于对照组（P0

27、.01)，而低于对照组(P0.01)；高尔基体的Sv和均低于对照组(P0.05)(见表2)。六、DM组与对照组血清、肺组织SOD活性、MDA含量测定DM组大鼠血清SOD活性显著低于对照组（P0.01），而MDA含量高于对照组(P0.01)；DM组大鼠肺组织SOD活性与对照组无显著差异(P0.05),但MDA含量高于对照组(P0.01)(见表3)。Control group Diabetic groupSerum SOD(U/mL) 22.93±3.5615.04±4.67*Lung SOD(U/100 mg) 20.57±3.6219.49±4.85Se

28、rum MDA(nmol/mL)11.59±4.2618.89±5.43*Lung MDA(nmol/100mg) 17.21±3.4321.65±1.78*     * P0.01, vs control group 讨论四氧嘧啶是酰脲酸衍生物，在国内外被广泛应用于诱导建立与人类1型DM近似的动物模型，它主要损伤大鼠胰腺、肾、肾上腺、甲状腺、垂体和肝脏，而对肺脏无明显的影响。因此，我们采用四氧嘧啶复制的早期DM大鼠模型，了解DM肺脏变化。从表1及1可以看出DM大鼠肺病变以肺泡数量增多为其特征。其原因可能是DM时肺

29、胶原和弹性蛋白增加3，促进胶原、弹性蛋白交联形成的赖氨酰氧化酶活性增强4， 增加了胶原弹性蛋白交联和结缔组织网的再改造，同时，胰岛素缺乏可致肺表面活性物质减少，肺泡内气腔体积变小，使每单位体积肺泡数量增加。但DM肺泡数量增加的病理生理学意义目前仍不清楚，尚需进一步研究。型肺泡细胞对于维持肺泡结构的功能和稳定具有重要作用。表2和3可以看出RER存在明显扩张与肿胀，提示型肺泡细胞内蛋白质合成、分泌及氧化磷酸化过程受损。这与DM时胰岛素缺乏，使型肺泡细胞核核糖核蛋白体对mRNA的翻译能力降低，减低蛋白质合成速率；同时，糖原合成减少，分解加强，葡萄糖利用受阻抑，蛋白质动员加强，使来自氨基酸的葡萄糖异生

30、作用加强等因素有关，进而引起DM肺代谢紊乱。DM大鼠型肺泡细胞高尔基体的Sv和下降与高尔基体小囊扩张干扰细胞内生物合成有关。DM 28d大鼠肺上皮细胞和毛细血管基底膜不同程度增厚，表明DM早期肺已存在微血管病变，其原因在于DM时肺结缔组织蛋白质合成增加,而降解率下降，使肺胶原和弹性蛋白含量升高5，致基底膜增厚，肺弥散量下降，影响肺功能。另外，可见 DM肺泡巨噬细胞伪足减少，可能与高血糖状态有关6。大量的基础与临床研究显示，DM存在明显的氧化应激 ( oxidative stress),其自由基增加与DM并发症明显相关7。DM 28d大鼠血清SOD活性降低，可明显削弱机体清除自由基的能力，从而参与DM慢性并发症的发生。而肺组织SOD 活性无变化，推测在DM早期，虽然自由基增加，但肺的代偿适应能力增强，以维持机体生理功能的相对平衡，使SOD活性无明显下降，具体机制有待进一步研究。DM血清及肺组织MDA含量均增加,表明DM状态下脂质过氧