AFFYMETRIX基因芯片操作流程

1、AFFYMETRIX基因芯片操作流程第一章 真核靶片断制备<一> RNA的抽提一、 哺乳动物细胞或组织RNA的抽提1.总RNA使用QIAGENs RNeasy Total RNA Isolation kit成功抽提哺乳动物细胞总RNA.哺乳动物组织作为RNA的来源，建议使用TRIzol抽提总RNA.2.Poly(A)+mRNA 哺乳动物细胞使用QIAGENs Oligotex Direct mRNA kit,从总RNA中抽提mRNA .哺乳动物组织作为RNA的来源，应首先使用TRIzol纯化，再进行一个Poly(A)+mRNA分离步骤或使用kit.二、 RNA沉淀1. 总RNA在用

2、RNeasy Total RNA Isolation kit分离或洗涤后没有必要沉淀总RNA.调整洗脱体积以制备cDNA合成接近希望的RNA浓度。注：为获得足够量的标记cRNA用来评估和基因芯片表达探针杂交，AFFYMETRIX建议开始合成cDNA的Poly(A)+mRNA最小浓度为0.02g/l时的最小量是0.2g, 总RNA 最小浓度为0.5g/l时的最小量是5g.这样有两个好处：（1） 有足够量在各步检查样品浓度和质量（2） 制备足够的cRNA用于杂交在TRIzol分离和热酚提取后需要乙醇沉淀；见下面方法.2. Poly(A)+mRNA大多数Poly(A)+mRNA分离过程都会导致得到较

3、稀浓的RNA，所以需要在cDNA合成前浓缩mRNA.3.沉淀步骤：（1） 加1/10体积3M NaOAc,PH5.2,和2.5倍体积乙醇.（2） 混匀，-20放置最少1小时.（3） 4,12000x g离心20分钟.（4） 80%乙醇洗涤沉淀2次.（5） 空气干燥沉淀.继续下面步骤前检查是否干燥.（6）4.RNA测定用分光光度计分析RNA浓度，在260nm 1单位吸光度等于40g/mlRNA.l 需要在260和280nm测定吸光度来确定样品的浓度和纯度l A260/A280应接近2.0为较纯的RNA(比值在1.9-2.1也可)<二>由纯化的总RNA合成双链cDNAAFFYMETRI

4、X强烈建议HPLC纯化T7-(d7)24 primer一、 第一链cDNA合成开始RNA的量:高质量RNA5.0g -40.0g纯化后RNA浓缩由260nm吸光度决定（1单位吸光度=40g/mlRNA），A260/A280应接近2.0，在1.8-2.1的范围内。建议在检测前跑一个琼酯糖电泳测定RNA质量。rRNA条带应该比较清晰没有明显的托影。cDNA合成前，DEPC处理水和逆转录的正确体积必须确定。它由加到反应中的RNA浓度和总体积决定。表1.1 第一链cDNA合成反应逆转录体积总RNA（g）SuperScript RT(l),200U/l5.0-8.01.08.1-16.02.016.1-

5、24.03.024.1-32.04.032.1-40.05.0RNA 和SuperScript RT体积不要超过12l合成反应应在1.5ML离心管中进行（RNase-free）表1.2 第一链cDNA合成成分反应试剂体积反应中最后浓度或量1:Primer Hybridization70放置10分钟稍微离心，放置冰上DEPC水到反应最后体积20lT7-(d7)24 primer1l100pmolRNA5.0-40g5.0-40g2:温度调节加到相应管子混合均匀42放置2分钟5×First strand cDNA buffer4l1×0.1M DTT2l10mM DTT10mM

6、 dNTP mix1l500M each3: 第一链合成加到相应管子混合均匀42放置1小时SuperScriptRT (200U/l)见表1.1200U-1000U总体积20l二、第二链cDNA合成1. 第一链反应放置冰上。稍微离心甩下管壁试剂2. 在第一链合成的管中加入下列第二链反应试剂（见表1.3）表1.3 第二链cDNA合成成分成分体积反应中最后浓度或量DEPC处理水91l5×Second strand cDNA buffer30l1×10mM dNTP mix3l200M each10U/l E.coli DNA ligase1l10U10U/l E.coli DN

7、A polymerase I4l40U2 U/l E.coli Rnase H 1l2U终体积150l3. 混匀。稍微离心，16放置2小时4. 加2l 【10U】T4 DNA polymerase5. 16放置5分钟6. 加10l 0.5M EDTA7. 继续纯化cDNA步骤,或-20储存<三>纯化双链cDNA一、 Phase Lock Gels (PLG)-酚/氯仿提取1.12000g 离心PLG管20-30秒，离下管壁PLG2. 加162l（等体积）的（25：24：1）酚：氯仿：异戊醇（10mM Tris-HCL PH8.0,1 mM EDTA饱和）到cDNA最后合成产物中（1

8、62l），最后体积到324l。混匀，稍微离心。3. 转移上液至PLG管4. 不要混合，PLG会混入溶液中。12000g 离心2分钟5. 转移上层水相到一个新的1.5ML离心管中。二、乙醇沉淀4OAC和2.5倍体积乙醇（-20储存）到样品中，混匀 2.立即在室温下12000g 离心20分钟 3.去上清，0.5ML 80%乙醇（-20储存）洗涤沉淀 4. 在室温下12000g 离心5分钟5.小心去掉80%乙醇，80%乙醇再洗涤一次6. 空气干燥沉淀.继续下面步骤前检查是否干燥7. 12l Rnase-free水重新溶解沉淀。<四>生物素标记cRNA合成参考BioArray High Y

9、ield RNA Transcript Labeling kit表1.4 cDNA in IVT(总RNA)总RNA（g）IVT中cDNA体积5.0-8.010l8.1-16.05l16.1-24.03.3l24.1-32.02.5l32.1-40.02l表1.5 cDNA体外转录成分成分体积纯化后的cDNA（含总RNA）5l水（Rnase-free）17l10×HY Reagent buffer4l10×Biotin Labeled Ribonucleotides4l10×DTT4l10×Rnase Inhibitor Mix4l20×T7

10、RNA Polymerase2l终体积40l37，4.5小时，600rpm振荡10秒/35分钟<五>纯化和质控体外转录（IVT）产物一、体外转录纯化l 不要用酚-氯仿提取生物素标记RNA,生物素能导致部分RNA进入有机相，得到的量会减少。l 保存部分没纯化的IVT产物凝焦电泳分析。l 建议先纯化一半IVT产物，在纯化另一分前测定cRNA量。u 如果样品在纯化过程中丢失，则可用保存的另一部分。u 如果IVT产物量很高，RNA的量则会超出纯化能力。那么纯化一半更好一点。l 纯化后的cDNA的最小浓度是 0.6g/l。 建议的IVT纯化方法（1） QIAGEN RNeasy Column

11、s(优先方法) （2）CHROMA SPIN-100(size exclusion spin columns)+EtOH沉淀QIAGEN RNeasy Columns纯化见试剂盒中参考手册建议：1.洗涤和洗脱之前将样品过柱两次。2.洗脱RNA时加水到柱子后，静置一分钟，再离心。CHROMA SPIN-100s和 EtOH沉淀法纯化1.加RNase-free水(60l)到IVT反应是体系至100l。2.50l（一半）样品装入柱子。3.50lRNase-free水洗柱，在用流过柱子的样品洗柱。二、乙醇沉淀（只适用于第二种纯化方法）4OAC和2.5倍体积乙醇（-20储存）到样品中，混匀。2.-20沉

12、淀1小时-过夜。3. 4，12000g 离心30分钟。储存）洗涤沉淀2次。空气干燥沉淀.继续下面步骤前检查是否干燥。5.10-20l RNase-free水重新溶解沉淀。三、cRNA质控用分光光度计分析RNA浓度.l 需要在260和280nm测定吸光度来确定样品的浓度和纯度l A260/A280应接近2.0为较纯的RNA(比值在1.9-2.1也可) 下面的计算公式确定调整cRNA的含量:调整cRNA含量=RNAm-(total RNAi)(y)RNAm=IVT后测得cRNA量 (g)total RNAi=开始总RNA的量 (g)y=在IVT过程中使用的Cdna的倍数 四、凝胶电泳检测样品同时跑

13、纯化和没有纯化的IVT产物有助于检测纯化过程丢失的范围。l 0.1%琼酯糖凝胶电泳分析0.1%的样品l RNA和loading dye混合，加热到65，5分钟<六>片断化cRNA表1.6片断化反应成分体积20g cRNA1-32l5×FragmentationBuffer8lRNase-free水到40l2. 94，35分钟。然后放置冰上。3. 变性凝胶电泳，至少需要1g cRNA。4. -20储存样品第二章 杂交1. 在新的1.5mL RNase-free离心管中按表2.1加入样品表2.1 杂交液成分Micro/MiniArrayMidiArrayStandardArr

14、ay终浓度片断化cRNA5g10g15g0.05g/lControl Oligonucleotide B2 (3nM)1.7l3.3l5l50pM20×Eukaryotic Hybridization Controls (bioB,bioC,bioD,cre)5l10l15l1.5,5,25,100pMrespectivelyHerring Sperm DNA (10mg/ml)1l2l3l0.1mg/mlAcetylated BSA(50mg/ml)1l2l3l0.5mg/ml2×Hybridization Buffer50l100l150l1×水至100l至2

15、00l至300l终体积100l200l300l20×Eukaryotic Hybridization Controls冻存，使用前65，5分钟2.使用前室温平衡探针3.99，5分钟4.通过加样孔加入适量体积（见表2.2）1×Hybridization Buffer湿润芯片5. 45，60rpm预杂交芯片10分钟6. 步骤3处理过的样品45，5分钟7. 最大速离心5分钟8. 从芯片中取出Buffer，加等体积处理好的杂交液9. 45，60rpm杂交芯片16小时表2.2Array杂交体积总体积Standard200l250lMidi130l160lMini80l100lMicr

16、o80l100l第三章 洗脱、染色、扫描芯片<一>实验和洗涤工作站设置一、进入Experiment Information洗脱、染色、扫描芯片之前都必须先定义一个Experiment二、准备洗涤工作站基因芯片洗涤工作站400用来洗脱和染色探针阵列。<二>洗脱和染色1.杂交16小时后，从芯片中取出杂交液装入一个新的离心管，放置冰上或-80长时间保存。2. Wash Buffer A充满芯片3.配制下列溶液表3.1 SAPE液（使用前配制，4储存）成分体积终浓度2×MES Stain Buffer600.0l1×50mg/ml acetyed BSA48

17、.0l2mg/ml1mg/ml Streptavidin-Phycoerythrin(SAPE)12.0l10g/mlDI 水540.0l总体积1200l表3.2抗体溶液成分体积终浓度2×MES Stain Buffer300.0l1×50mg/ml acetyed BSA24.0l2mg/ml10mg/ml Normal Goat IgG6.0l0.1mg/ml0.5mg/ml biotinylated antibody3.6l3g/mlDI水266.4l总体积600l表3.3标准格式EukGE-WS2Midi格式Midi-euk2Micro/Mini格式Micro-1v

18、1/Mini-euk2Post Hyb Wash#110 cycles of 2 mixes/cycle with Wash Buffer A at 2510 cycles of 2 mixes/cycle with Wash Buffer A at 3010 cycles of 2 mixes/cycle with Wash Buffer A at 25Post Hyb Wash#24 cycles of 15 mixes/cycle with Wash Buffer B at 506 cycles of 15 mixes/cycle with Wash Buffer B at 508 cy

19、cles of 15 mixes/cycle with Wash Buffer B at 50StainStain the probe array for 10minutes in SAPE solution at 25Stain the probe array for 5minutes in SAPE solution at 35Stain the probe array for 10minutes in SAPE solution at 25Post Stain Wash10 cycles of 4 mixes/cycle with Wash Buffer A at 2510 cycles

20、 of 4 mixes/cycle with Wash Buffer A at 3010 cycles of 4 mixes/cycle with Wash Buffer A at 302nd StainStain the probe array for 10minutes in antibody solution at 25Stain the probe array for 5minutes in antibody solution at 35Stain the probe array for 10minutes in antibody solution at 253nd StainStai

21、n the probe array for 10minutes in SAPE solution at 25Stain the probe array for 5minutes in SAPE solution at 35Stain the probe array for 10minutes in SAPE solution at 25Final Wash15 cycles of 4 mixes/cycle with Wash Buffer A at 30The holding temperature is 2515 cycles of 4 mixes/cycle with Wash Buff

22、er A at 35The holding temperature is 2515 cycles of 4 mixes/cycle with Wash Buffer A at 35The holding temperature is 25<三>扫描<四>关闭洗涤工作站附：溶液配制5×RNA Fragmentation Buffer:(200mM Tris-acetate,PH 8.1,500mM KOAc,150mM MgOAc)4.0ml 1M Tris-acetate,PH 8.1(冰醋酸调节PH)0.64g MgOAc0.98g KOAcDEPC处理水至20ml强烈搅拌，混合均匀0.2m过滤室温保存12×MES Stock：(1.22M