酶的固定化技术及其应用

1、酶工程课程论文题目：酶的固定化技术及其应用学院：食品学院专业：食品科学与工程班级：食品101（35）2012-11-21酶的固定化技术及其应用摘要：酶的固定化技术是酶工程研究领域的一项重点和热点技术之一，酶的固定化技术可以显著提高酶的利用率，降低酶生产的成本。本文主要研究酶的固定化技术，酶固定化的优缺点，以及在食品，医药，环境中的应用。并对其研究的前景进行了简洁的预测。关键字：酶 固定化技术 应用酶作为一种生物催化剂，因其催化作用具有高度专一性、催化条件温和、无污染等特点，广泛应用于食品加工、医药和精细化工等行业。但在使用过程中，人们也注意到酶的一些不足之处，如酶稳定性差、不能重复使用，并且反

2、应后混入产品，纯化困难，使其难以在工业中更为广泛的应用。因此为适应工业化生产的需要，人们模仿人体酶的作用方式，通过固定化技术对酶加以固定改造，来克服游离酶在使用过程中的一些缺陷。 固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。与传统的酶相比，固定化酶具有游离酶所不可比拟的优点.同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；稳定性显著提高；可长期使用，并可预测衰变的速度；提供了研究酶动力学的良好模型等一系列的优点。用于固定化的酶，起初都是采用经提取和分离纯化后的酶，随着固定化技术的发展，也可采用含酶

3、细胞或细胞碎片进行固定化，直接应用细胞或细胞碎片中的酶或酶系进行催化反应由于微生物细胞可直接作为酶源，所以逐渐产生了固定化细胞技术 固定化细胞的优点是：(1)省去了酶分离纯化的时间和费用；(2)可进行多酶反应；(3)保持了酶的原始状态，从而增加了酶的稳定性但固定化细胞与固定化酶相比，也存在一些不足之处：(1)因为产生副反应和所需生化产物的进一步代谢，使固定化完整细胞生产的产物纯度可能比固定化酶低；(2)细胞使用相当长的时间后，常常会发生自溶，尤其是在细胞有可能进行增殖时，细胞的漏出就特别明显：(3)单位体积反应器内固定化细胞的活性总是比相应的固定化酶活性低酶的固定化方法主要可分为四类：吸附法、

4、包埋法、共价键结合法和交联法等。吸附法和共价键结合法又可统称为载体结合法。1包埋法包埋固定化法是把酶定位于聚合物材料的格子结构或微胶囊结构中这样可以防止酶蛋白释放，但是底物仍能渗入格子内与酶相接触此法较为简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性破坏少，但此法对大分子底物不适用(1)凝胶包埋凝胶包埋法是将酶包埋在交联的水不溶性凝胶的空隙中的方法交联聚丙烯酰胺凝胶包埋法是首先被采用的包埋技术Bernfeld和Wan(1963)用此法固定了胰蛋白酶、木瓜蛋白酶用此方法后来又固定了过氧化氢酶、胰凝乳蛋白酶,葡萄糖苷酶,近年，又有人使用天然材料如藻酸盐和卡拉胶进行包埋(2)微胶囊包埋将酶包埋于半透性聚合体

5、膜内，形成直径为1100um的微囊这种固定化酶是以物理方法包埋在膜内的，只要底物和产物分子大小能够通过半透膜，底物和产物分子就能够以自由扩散的方式通过膜2吸附法吸附固定是最简单的方法，酶与载体之间的亲和力是范德华力、离子键和氢键此方法又可分为物理吸附法和离子吸附法(1)物理吸附法使用对蛋白质具有高度吸附能力的非水溶性载体，如活性碳质,多孔玻璃等作为吸附剂，将酶吸附到表面上使酶固定化这种方法操作简单反应条件温和，载体可反复使用，但结合不牢固，酶易脱落(2)离子吸附法利用酶蛋白在解离状态下可用电荷引力而固着于带有与酶蛋白电荷相异的离子交换剂(水不溶性载体)上的固定化方法此法操作简单，固定较为牢固，

6、在工业上用途颇广常用的载体有阴离子交换剂(如：DEAE(二乙氨基乙基)一纤维素,TEAE(四乙氨基乙基)一纤维素，DEAE一葡聚糖凝，和阳离子交换剂(如：羧甲基纤维素(CMC)3共价法酶蛋白分子上的官能团和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键连接的方法其优点是酶与载体之间的连接很牢固，稳定性好，但反应条件激烈，操作复杂，控制条件苛刻目前，已建立的方法包括：(1)重氮法这是共价键法中使用最多的一种，将具有氨基的不溶性载体，以稀盐酸和亚硝酸钠处理，成为重氮化物，再与酶分子偶联酶蛋白中的游离氨基，组氨酸中的咪唑基，酪氨酸中的酚基，可与其结合(2)肽键法此法是将有功能基团的载体与酶蛋白中赖氨酸的e

7、一氨基或N末端的a一氨基作用形成肽键，成为固定化酶(3)烷基化法和芳基化法以卤素为功能基团的载体与酶蛋白的氨基或巯基发生烷基化或芳基化反应，形成固定化酶4交联法使酶与带两个以上的多官能团试剂进行交联反应，生成不溶于水的二维交联聚集体，交联形成的固定化酶称为交联酶与共价结合法一样，都是靠化学结合的方法使酶固定化其区在于交联法使用了交联剂常用的交联剂有戊二醛，鞣酸啪单用戊二醛交联得到固定化酶的方法很少单独使用将此法与吸附法或包埋法联合使用可以达到良好的加固果例如：先用几丁质吸附，再用戊二醛交联等 5其他方法(1)物理方法将酶限制在半透膜或超滤膜中，使酶仍以天然状态(可溶的)长期连续使用用此方法固定

8、的酶有蔗糖酶，酰胺酶等(2)利用可溶性一不溶性载体1989年，Masayuki等报道了肠溶衣聚合物(Enteric coating polmer)Eudragitl.当pH<40时，呈不可溶性(有利于酶的回收)，当pH>50时，呈可溶性(有利于酶接近不容性底物)作者用此法固定了纤维素酶固定化酶的性质酶在水溶液中以自由的游离状态存在，但是固定后酶分子便从游离的状态变为牢固地结合于载体的状态，其结果往往引起酶的性质的改变。为此，在固定化酶的应用过程中，必须了解固定化酶的性质与游离酶之间的差别，并对操作条件加以适当调整，酶固定化后所引起的酶性质的改变，一般认为其原因可能有两种：一是使酶本

9、身变化；二是受固定化载体的物理或化学性质的影响所谓酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化；载体影响，则主要体现在固定化酶的周围，形成了能对底物产生影响的扩散层，以及静电的相互作用等引起的(1)温度酶被固定化以后，其最适温度比天然酶高一些，一般因酶而异，大致提高515。C范围(2)稳定性酶经固定后，稳定性都有所增加，稳定性的提高包括对各种试剂的稳定性、对蛋白酶的稳定性、热稳定性的贮存及操作稳定性等(3)pH值。酶和细胞经固定化后，其最适pH及pH活性曲线有时发生变化，有时则不发生变化据报道，最适pH的变化是由载体的静电荷决定的，用聚合阳离子作载体，其最适pH

10、比固定化前向酸性一侧偏移1个pH单位这可解释为：当酶被结合到聚合阳离子载体上时，酶蛋白的阳离子数增多，从而造成固定化酶反应区域pH值比外部溶液偏碱这样，实际上酶的反应是在反应液的pH偏碱的一侧进行的，从而使最适pH值转移到了酸性一侧，若用聚合阴离子作载体，则与上述情况相反，最适pH值移向碱性一侧在膜的一侧或固定膜上，酶反应可连续进行，提高了酶的利用效率，反应产物通过半透膜透去，消除了产物对酶反应的抑制，使酶反应不断朝着生成产物的方向进行驯中空纤维反应器也是一种应用较多的反应器旧目前多酶反应器的研究很多，但由于工艺的复杂性，工业化应用的例子很少 7. 固定化酶的应用与游离酶相比，固定化酶在保持其

11、高效专及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，酶经过固定化后，能耐受温度及pH值的变化，催化反应连续可控、工艺流程简便。崮定化酶作为现代生物技术的一万方个新领域，发展很快。目前已广泛应用干食品医药、轻工、环保等领域。在精细有机合成，临床分析和微量有害物质检测方面的应用也在不断扩展。21 在食品工业中的应用酶固定化在食品工业中的应用是早期发展起来的一个传统领域。其中最常用的，也是规模最大的过程，就是采用固定化葡萄糖异构酶，从葡萄糖生产高果糖浆。其它还包括采用固定化乳糖酶去除牛乳中的乳糖、采用固定化脂肪酶通过转酶反应生产可可油替代品、采用固定化耐热蛋白酶制造甜味剂2天冬甜精，以及应

12、用固定化L2天冬酶从富马酸铵生产天冬氨酸等在饮料加工过程中利用漆酶可以氧化酚类物质，使其聚合，这既可使果汁在加工过程中快速澄清，又解决了果汁长时间储存所产生的后浑浊问题(且不用聚乙烯吡咯烷酮、活性炭及吸附剂处理)污染问题少，有报道显示可将固定化的漆酶用于苹果汁的澄清和儿茶酸的去除”22在医学和临床中的应用药用酶可通过固定化提高其稳定性及缓释性、并可除去免疫原性。前列腺素衍生物是20世纪发现的重要药物之一，用大孔径N2聚氨乙基丙烯酰胺为载体，使前列腺素合成酶固定化，合成前列腺素衍生物E1，显示出良好的活性及贮存稳定性"。微囊固定化过氧化氢酶具有良好的酶活性及稳定性，在临床检测及卫生防疫

13、方面具有广泛用途”。固定化酶还可应用于临床检测分析，如萤火虫荧光素酶的生物传感器在医学等诸多领域有着现实的和潜在的应用前裂。23在环境保护中的应用固定化酶一个很大的用途是处理废水中一些有毒有害物质，防止污染。其中漆酶的固定化应用较为广泛，酚类化合物是废水中一类常见的高含量污染物，漆酶可以催化氧化酚类化合物，而且不用加入过氧化物酶，在废水处理中，由于组分复杂而且经常变化，利用单一的固定化酶很难收到好的处理效果。因此，要用多酶固定化体系组合处理，才能使有机物全矿化和保持无害稳定排放。如德国有人将九种对硫磷农药降解具有活性的酶，共价组合固定在多孔玻璃珠和硅胶上制成固定化酶，填充到柱状反应器中处理含硫

14、磷农药废水，可获得95以上的处理效果。连续工作70d酶的活性没有变化。日本有人用固定化的淀粉酶处理淀粉废水和造纸废水。美国科学家贝报道了二氧化硅凝胶为载体的固定化酶传感器在监测大气中二氧化碳含量变化中的应用例。3展望固定化技术作为一项新兴技术有着不可限量的活力，引起了酶工业极大的变化。固定化酶作为第二代酶制剂正日益成为酶应用方面的生力军。开发新型固定化技术、改进传统固定化方法是酶固定化研究的主要趋势。生物技术，特别是蛋白质工程和基因重组等分子生物学技术的发展和酶固定化技术可以相互补充，必将对固定化酶在环境保护、食品工业、医药卫生等领域的应用起到更大的推动作用。保护、食品工业、医药卫生等领域的应

15、用起到更大的推动作用。 1 陶声等固定化酶理论与应用，北京：轻工业出版社，19872 田沈应用与环境生物学报，1999；5：80833 拜永孝。李彦锋，马应霞，等同定化酶技术及其应用J化学通报，2005，(68)：1-64 陈雄同定化糖化酶的研究J中国酿造，2001，112(2)：19205 Xi F N。Wu JM。Jia Z S，et a1Preparation and characterization oftrypsin immobilized on silica gel supported macro porous chitosanbeadJProcess Biochemistry2005，40：2833-28406 Martinez AJ。Manolahe SImmobilized biomaterials on plasmationalized cellophane covalently attached achymotrypsinJJou