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1、树舌灵芝深层发酵培养基的优化研究摘要：通过单因素试验，确定树舌灵芝的适宜氮源为豆饼粉，适宜碳源为米糠和蔗糖；在此基础上，以筛选的碳源、氮源和无机盐KH2PO4 和MgSO4·7H2O为考察因素，以总三萜产量为主要指标利用正交试验优化培养基配方比例，确定树舌灵芝液体发酵培养基最佳配方为：米糠4%、蔗糖1%、豆饼粉4%、KH2PO4 0.2%、MgSO4·7H2O 0.05%。关键词：树舌灵芝；深层发酵；正交设计；培养基优化；总三萜产量Optimization of the Submerged Fermentation Medium of Ganoderma applanatu

2、mAbstract: In order to find the optimum culturing medium of Ganoderma applanatum, single factor test in culturing utensil was carried out. The result showed that rice bran and sucrose could be used as the mixed carbon sources, and soybean powder as the nitrogen sources. Then, in the orthogonal test,

3、 C-sources, N-sources and inorganic salts KH2PO4 and MgSO4·7H2O were considered as influencing factors, and the total triterpene content as the major performance indicators. The optimum medium components were as follows: rice bran 4%, sucrose 1%, soybean powder 4%, KH2PO4 0.2%, MgSO4·7H2O

4、0.05%.Key words: Ganoderma applanatum; submerged fermentation; orthogonal test; medium optimization; total triterpene content树舌灵芝(Ganoderma applanatum)又称树舌扁灵芝，属于真菌门(Eumycota)、担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、非菌褶目(Aphyllophorales)、灵芝菌科(Ganodermataceae)、灵芝属(Ganoderma) 1。树舌具有广泛的药理活性2-12，民间用其治疗

5、食道癌、肺结核，临床用于治疗腹水癌、神经系统疾病、肝炎、心脏病、糖尿病和糖尿病并发症，预防和治疗胃溃疡、急慢性胃炎、十二指肠溃疡、胃酸过多等胃病。另外研究表明，树舌三萜类物质具有血压双向调节、抗肿瘤、抗病毒等药理活性13-14。目前国内对树舌灵芝的化学成分和药理学研究得比较多，但对树舌灵芝深层发酵方面的研究较少15。深层发酵培养树舌菌丝体具有发酵周期短、工艺简单、易控制、适于工业化大生产等优点16。本试验应用高氯酸香草醛显色法17-18来测定树舌灵芝发酵菌丝总三萜类化合物含量，以总三萜产量为基准，筛选出树舌灵芝深层发酵的最适培养基。1. 材料和仪器1.1 供试菌株树舌灵芝子实体采自于江苏省常熟

6、地区。1.2 实验材料硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、硝酸钾、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、磷酸氢二钾、硫酸镁、高氯酸、冰醋酸、香草醛均为分析纯；齐墩果酸对照品，中国药品生物制品检定所；豆饼粉、玉米粉、麦芽粉、甘薯粉、米糠和麸皮均为提取液，煮沸0.5h后用纱布过滤制得。1.3 主要仪器DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精密实验设备有限公司；YXQ-LS-SII全自动立式电热压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；FA1104型电子天平，上海良平仪器仪表有限公司；JH 755B紫外分光光度计，上海菁华科技有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，金坛市富华仪器有限公司；KQ 320

7、0E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；HYG摇床，上海欣蕊自动化设备有限公司；SZX-1D超净工作台，苏净集团安泰公司。2. 实验方法2.1 基本培养基2.1.1 斜面培养基PDA培养基为土豆20%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH自然。接一块绿豆粒菌块接种于PDA培养基的中央，25恒温培养7天。2.1.2 液体培养基玉米粉1%，蔗糖2%，蛋白胨0.5%，KH2PO4 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH自然。2.1.3 氮源筛选培养基葡萄糖2%，可溶性淀粉1%，KH2PO4 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，PH自然。分别以豆饼粉、麸皮、蛋白胨、酵母

8、膏、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、硝酸钾为氮源，添加量为2%。2.1.4 碳源筛选培养基麸皮2%，KH2PO4 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH自然。分别以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉、麦芽粉、甘薯粉、米糠等为碳源，添加量为3%。2.2 培养方法2.2.1 种子液制备将斜面菌种分割成黄豆大小，接种到液体培养基中，250mL三角瓶装液量100mL，于25，120r/min振荡培养10d得一级种。将已经培养好的一级种以体积分数10%接种到同样液体培养基中，500mL三角瓶装液量200mL，在与一级种同样条件下培养7d得种子液备用。2.2.2 培养基筛选将制备好的种子液按体积

9、分数10%接种量接种到不同的碳氮源培养基及正交试验筛选培养基中，250mL三角瓶装液量100mL，于25，120r/min振荡培养7d后收集菌丝体。分析不同碳源、氮源对菌丝体生物量和三萜总量的影响。每次试验重复3次，结果取平均值。2.2.3 混合碳氮源培养基正交试验根据单因素试验筛选结果，并考虑到低投入高产出的原则，选用米糠和蔗糖作为复合碳源，豆饼粉作为氮源，磷酸二氢钾和硫酸镁作为无机盐，按L9（34）设计四因素三水平试验，9个组合，4次重复，优化培养基配方见表1。表1 正交实验因子水平表（单位：%）因素水平A（米糠）B（蔗糖）C（豆饼粉）D（KH2PO4+MgSO4）12120.10.052

10、31.530.20.0534240.20.12.3 发酵菌丝体生物量测定采用细胞干重法，取100ml发酵液，用100目纱网过滤得菌丝体，并用蒸馏水反复冲洗，至滤出液澄清为止，收集菌丝体，60烘干至恒重，称重。2.4 三萜含量测定2.4.1 标准溶液的制备（200g/ml齐墩果酸）精确称取干燥至恒重的齐墩果酸20mg，置于100ml的容量瓶中加无水乙醇溶解，并定容至刻度，作为对照品溶液。2.4.2 样品溶液的制备 取样品0.5g（精确到万分之一），加入10ml无水乙醇，超声波提取30min后，摇匀，过滤，取滤液，定容至50mL，即得样品溶液。用分光光度法19-20测定样品中灵芝三萜物质含量。2.

11、4.3 标准曲线的制作 精密吸取齐墩果酸标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL, 于6只具塞磨口试管中。加5%香草醛-冰醋酸液0.4mL，摇匀。再加入0.6mL高氯酸，置60水浴20 min，冰浴冷却后，加冰醋酸5.0 mL，摇匀，置于室温15 min后，按分光光度法（中国药典2005版I部附录VA）21，以试剂为空白，在545nm处比色测定吸光度值。以齐墩果酸浓度（mg/ml）为横坐标，吸光度A为纵坐标，作图得标准曲线。2.4.4 样品的测定 吸取1ml样品溶液，按标准曲线方法测定吸光度。用标准曲线法计算样品中总三萜酸提取物质量。3. 结果与分析3.1 树舌灵芝对氮素营养

12、的利用氮源是食用菌细胞合成蛋白质和核酸必不可少的主要原料，树舌灵芝可利用的氮源比较广泛。不同氮源对树舌灵芝菌丝生长和总三萜产量影响的数据及多重比较见表2、表3和图1。表2 氮源对树舌灵芝菌丝生物量影响的多重比较N源菌丝生物量均值（g/dL）差异显著性a=0.05a=0.01豆饼粉1.50aA麸皮0.88bB酵母膏0.73cC蛋白胨0.45dD硫酸铵0.15eE硝酸钾0.14eE硝酸铵0.10eE氯化铵0.10eE表3 氮源对树舌灵芝菌丝总三萜产量影响的多重比较N源菌丝总三萜产量均值（mg/dL）差异显著性a=0.05a=0.01豆饼粉43.60aA麸皮13.17bB酵母膏9.61cC蛋白胨7.

13、95dC硫酸铵2.17eD氯化铵1.88eD硝酸钾1.03eD硝酸铵0.74eD由表2和图1可知，树舌灵芝菌丝能够较好的利用豆饼粉，其次是麸皮，两者生物量差异极显著（P0.01），对酵母膏、蛋白胨利用次之，对硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾、氯化铵的利用最差。由表3和图1可知，以豆饼粉为氮源培养时菌丝总三萜产量最高，其次是麸皮，两者总三萜产量差异极显著（P0.01），对酵母膏、蛋白胨利用次之，对硫酸铵、氯化铵、硝酸钾、硝酸铵的利用最差。因此，选用豆饼粉作为树舌灵芝发酵的适宜氮源。图1 氮源对菌丝体生物量和三萜产量的影响3.2 树舌灵芝对碳素营养的利用碳源是发酵培养基的基础，它既能被菌丝体利用合成细胞结构

14、，又是菌丝体产生各种代谢产物和细胞内储藏物质的主要原料。不同碳源对树舌灵芝菌丝生长和总三萜产量影响的数据及多重比较见表4、表5和图2。表4 碳源对树舌灵芝菌丝生物量影响的多重比较C源菌丝生物量均值（g/dL）差异显著性a=0.05a=0.01可溶性淀粉0.90aA玉米粉0.71bB甘薯粉0.70bB米糠0.43cC蔗糖0.42cC葡萄糖0.36cC麦芽糖0.36cC由表4和图2可知，树舌灵芝菌丝能够较好的利用可溶性淀粉，其次是玉米粉和甘薯粉，前者和后两者生物量差异极显著（P0.01），对米糠、蔗糖利用次之，对葡萄糖、麦芽糖的利用最差。由表5和图2可知，以蔗糖为碳源培养时菌丝总三萜产量最高，其次

15、是米糠，两者总三萜产量差异极显著（P0.01），对可溶性淀粉、葡萄糖利用次之，对甘薯粉、玉米粉、麦芽糖的利用最差。由于可溶性淀粉和葡萄糖价格较贵，在发酵过程中大量应用不符合生产中低投入、高产出的原则，因此选用廉价的天然碳源米糠和蔗糖作为复合碳源，降低成本。表5 碳源对树舌灵芝菌丝总三萜产量影响的多重比较C源菌丝总三萜产量均值（mg/dL）差异显著性a=0.05a=0.01蔗糖16.48aA米糠10.49bB可溶性淀粉9.90bB葡萄糖9.70bB甘薯粉6.97cC玉米粉6.81cC麦芽糖5.74cC图2 碳源对菌丝体生物量和三萜产量的影响3.3 正交试验优化培养基的组成根据单因素试验结果，选取

16、米糠、蔗糖、豆饼粉和无机盐KH2PO4，MgSO4·7H2O为考察对象，利用正交试验对树舌灵芝发酵培养进行了优化，结果见表6和图3。由表6正交数据极差分析结果（其中Ri代表生物量极差，Rj代表菌丝体胞内三萜含量极差，Rk代表菌丝体胞内三萜产量极差）可知，各因素对菌丝生物量的影响大小依次为A>C>D>B,对菌丝体胞内三萜含量的影响大小依次为A>D>C>B,对菌丝体胞内三萜产量的影响大小依次为A>B>D>C。表6 L9（34）正交试验结果的极差分析试验号ABCD生物量(g/dL)三萜质量分数(%)总三萜产量(mg/dL)111110.

17、770.735.66212220.971.3913.44313331.150.9911.40421230.923.1128.59522311.041.5115.66623120.971.8918.28731322.143.2569.41832131.342.836.18933211.632.5842.050.961.281.03 1.15 0.981.121.17 1.36 1.701.251.441.14Ri0.740.160.420.221.042.361.811.612.171.902.362.182.881.821.922.30Rj1.840.540.550.6910.1734.552

18、0.0421.1220.8421.7628.0333.7149.2123.9132.1625.39Rk39.0512.8012.1212.58从发酵菌丝体生物量来考察各因素水平值，A可取A3，B可取B1，C可取C3，D可取D2；从发酵菌丝体三萜产量来考察各因素水平值，A可取A3，B可取B1，C可取C3，D可取D2；从发酵菌丝体三萜含量来考察各因素水平值，A可取A3，B可取B1，C可取C2，D可取D3。由图3可以看出，菌丝体三萜产量主要受生物量的影响，二者变化趋势相同。因此，以菌丝体生物量和三萜产量为指标确定最佳培养基为A3B1C3D2，即米糠4%、蔗糖1%、豆饼粉4%、KH2PO4 0.2%、

19、MgSO4·7H2O 0.05%。图3 实验因素与指标趋势4. 结论与讨论综合上述实验结果，可确定树舌灵芝液体培养的适宜培养基如下: 米糠4%，蔗糖1%，豆饼粉4%，KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH自然，0.1 MPa，121灭菌30 min。结果表明，树舌灵芝对不同的碳源和氮源的利用率是有差异的。对碳源来说，树舌灵芝对高分子碳源的利用较好，对小分子碳源的利用较差。对于氮源来说，树舌灵芝对有机氮源和天然氮源的利用较好，对天然氮源豆饼粉的利用最好。正交试验结果显示，在树舌灵芝的深层发酵培养基中,米糠是影响树舌灵芝菌丝体生物量的

20、主要因素，也是影响其菌丝体三萜产量的主要因素，而且树舌灵芝菌丝体三萜质量分数不随生物量的增加而增加，且两者间无明显相关性，但三萜产量主要受菌丝体生物量的影响，两者变化趋势一致。另外，随着培养基中无机盐添加量的增加，树舌灵芝菌丝体生物量和三萜质量分数均呈下降趋势，这表明少量无机盐可促进树舌灵芝菌丝体的生长和三萜的积累，若添加量过多，会抑制其生长。参考文献1 卯晓岚中国大型真菌M郑州：河南科学技术出版社，2000，4832 周忠波，马红霞，图力古尔树舌（Ganoderma lipsiense）化学成分及药理学研究进展J菌物研究，2005，3（1）：35-423 谢宗万，余友芩全国中草药名鉴(上册)M北京：人民卫生出版社，1996：1614 中药辞海编写组中药辞海M北京：中国医药科技出版社，1999：1451-14525 潘洪明，于英君树舌多糖、猪苓多糖对小鼠HepA瘤细胞TNF-表达的影响J中国基层医药，2002，9（6）：486-4876 于英君，刘丽波树舌多糖GF免疫调节作用研究J中医药信息，1999，16（2）：64-647 唐丽霞，王百龄复方树舌片治疗慢活肝142例疗效观察J河北中西医结合杂志，1996，5（4）：86-868 王百龄，卢少琪复方树舌片治疗慢性活动性肝炎142例J. 新药与临床，1990，9（5）：307-3089