仪器分析色谱导论

1、第四章第四章 色谱分析法导论色谱分析法导论4.1 4.1 概述概述4.2 4.2 色谱流出曲线色谱流出曲线4.3 4.3 色谱法基本原理色谱法基本原理4.4 4.4 色谱定性和定量分析色谱定性和定量分析 1906 1906年，俄国植物学家年，俄国植物学家茨维特茨维特在分离植物叶子中的色素时，将叶在分离植物叶子中的色素时，将叶片的石油醚（饱和烃混合物）提取片的石油醚（饱和烃混合物）提取液倒入一根装有液倒入一根装有CaCOCaCO3 3粉末的竖直玻粉末的竖直玻璃管中，再加入纯的石油醚任其自璃管中，再加入纯的石油醚任其自然流下，一会儿柱中出现不同颜色然流下，一会儿柱中出现不同颜色的谱带，植物浸取液中

2、的色素得到的谱带，植物浸取液中的色素得到了分离。了分离。4-1 4-1 概述概述 色谱法的产生色谱法的产生 色谱法中包含两相色谱法中包含两相 固定相固定相固定不动的相固定不动的相 CaCOCaCO3 3 流动相流动相推动混合物流动的液体推动混合物流动的液体 石油醚石油醚 色谱法色谱法：一种重要的一种重要的分离分离分析方法，混合物在流动分析方法，混合物在流动相的携带下通过色谱柱分离出几种组分的方法相的携带下通过色谱柱分离出几种组分的方法。1 1、按两相状态分类、按两相状态分类气相色谱（气相色谱（GCGC）液相色谱（液相色谱（LCLC）超临界流体色谱（超临界流体色谱（SFCSFC）气固色谱气固色谱

3、 GSCGSC固体吸附剂固体吸附剂气液色谱气液色谱 GLC GLC 液体液体液固色谱液固色谱 LSCLSC固体吸附固体吸附剂剂液液色谱液液色谱 LLCLLC液体液体2 2、按操作形式分类、按操作形式分类（1 1）柱色谱：）柱色谱：固定相装在柱管内的色谱法。固定相装在柱管内的色谱法。（2 2）纸色谱：）纸色谱：滤纸为固定相的色谱法，流动滤纸为固定相的色谱法，流动相是含一定比例水的有机溶剂，样品在滤纸相是含一定比例水的有机溶剂，样品在滤纸上展开进行分离。上展开进行分离。（3 3）薄层色谱：）薄层色谱：把固体固定相压成或涂成薄把固体固定相压成或涂成薄膜的色谱法。膜的色谱法。 3 3、按分离原理分类、

4、按分离原理分类 （1 1）吸附色谱：）吸附色谱：利用吸附剂表面对被分离的各组分利用吸附剂表面对被分离的各组分吸附能力不同进行分离。吸附能力不同进行分离。 （2 2）分配色谱：）分配色谱：利用固定液对各组分的溶解能力不利用固定液对各组分的溶解能力不同进行分离。同进行分离。 （3 3）离子交换色谱：）离子交换色谱：利用离子交换剂对各组分的亲利用离子交换剂对各组分的亲和力不同进行分离。和力不同进行分离。 （4 4）凝胶色谱：）凝胶色谱：利用凝胶对分子的大小和形状不同利用凝胶对分子的大小和形状不同的组分所产生的阻碍作用不同而进行分离的色谱法。的组分所产生的阻碍作用不同而进行分离的色谱法。 4 4-2

5、-2 色谱图及色谱常用术语色谱图及色谱常用术语一、色谱图一、色谱图 1 1、基线基线在实验操作条件下，色谱柱后没有在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流出的曲线样品组分流出的曲线称为基线。稳定的基称为基线。稳定的基线应该是线应该是一条水平直线一条水平直线。2 2、峰高峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（以（h h）表示。表示。峰高低与组分浓度有关，峰峰高低与组分浓度有关，峰越高越窄越好。越高越窄越好。 二、色谱图中的基本术语二、色谱图中的基本术语 标准偏差标准偏差峰高峰高0.6070.607倍处的色谱峰宽的一半。倍处的色谱峰宽的一半。 半峰宽半峰宽Y Y1

6、/21/2峰高一半处对应的峰宽。峰高一半处对应的峰宽。 Y Y1/21/2 =2.354=2.354 基线宽度基线宽度Y Y色谱峰两侧拐点所作切线在基线上色谱峰两侧拐点所作切线在基线上的距离。的距离。 Y =4Y =44 4、色谱色谱峰面积峰面积A A色谱峰与峰底所围的面积。色谱峰与峰底所围的面积。3 3、色谱峰的宽度、色谱峰的宽度（1 1）死时间死时间t t0 0不被固定相吸附或溶解的组分流经不被固定相吸附或溶解的组分流经色谱柱所需的时间。色谱柱所需的时间。（2 2）保留时间保留时间t tR R组分流经色谱柱时所需时间。组分流经色谱柱时所需时间。（3 3）调整保留时间调整保留时间t R扣除了

7、死时间的保留时间。扣除了死时间的保留时间。t R =t=tR R-t-t0 0*t R体现的是组分在柱中被吸附或溶解的时间，体现的是组分在柱中被吸附或溶解的时间，更合更合理的反映了被测组分的保留特性。理的反映了被测组分的保留特性。 5 5、色谱保留值色谱保留值定性的依据定性的依据（5 5）死体积死体积V V0 0指色谱柱在填充后，柱管内固定指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两相很小可的空间以及检测器的空间的总和。当后两相很小可忽略不计时，忽略不计时，死体积就是色谱柱中的所有空隙的

8、总死体积就是色谱柱中的所有空隙的总体积体积。死体积与死时间关系：。死体积与死时间关系：V V0 0 = t= t0 0F F0 0 式中，式中，F F0 0为柱后出口处流动相的体积流速。为柱后出口处流动相的体积流速。（6 6）保留体积保留体积V VR R指从进样开始到被测组分在柱后指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大值时所通过的流动相体积出现浓度极大值时所通过的流动相体积。V VR R= t= tR RF F0 0（7 7）调整保留体积调整保留体积V VR R扣除了死体积的保留体积。扣除了死体积的保留体积。V V R R=V=VR R V V0 0=t=t R RF F0 0（8 8）相对

9、保留值相对保留值在相同操作条件下，组分在相同操作条件下，组分2 2对另一对另一参比组分参比组分1 1调整保留值调整保留值之比。之比。1 , 2r色谱流出曲线的意义：色谱流出曲线的意义：色谱峰数色谱峰数= =样品中单组份的最少个数；样品中单组份的最少个数；色谱保留值色谱保留值定性依据；定性依据；色谱峰高或面积色谱峰高或面积定量依据；定量依据；色谱保留值或区域宽度色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标；色谱柱分离效能评价指标；色谱峰间距色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。固定相或流动相选择是否合适的依据。三、分配平衡三、分配平衡 在一定温度和压力下，组分在流动相和固定相之在一定温度和压

10、力下，组分在流动相和固定相之间所达到的平衡叫分配平衡。组分在两相中的分配行间所达到的平衡叫分配平衡。组分在两相中的分配行为常采用为常采用分配系数分配系数K K和分配比和分配比 来表示。来表示。kw 分配比分配比也是由组分、固定相和流动相的热力学性质决定的。也是由组分、固定相和流动相的热力学性质决定的。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。体积有关。w 分配比分配比越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称容量比或容量因子。它是量大，因此又称容量比或容量

11、因子。它是衡量色谱柱对被分离衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。组分保留能力的重要参数。w 分配系数是由组分、固定相和流动相的热力学性质决定的，分配系数是由组分、固定相和流动相的热力学性质决定的，它是一定色谱条件下每种溶质的特征值它是一定色谱条件下每种溶质的特征值。它仅与柱温、柱压有。它仅与柱温、柱压有关，而与两相体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关。关，而与两相体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关。不同不同组分分配系数的差异是实现色谱分离的先决条件。组分分配系数的差异是实现色谱分离的先决条件。4 4-3 -3 色谱法的基本理论色谱法的基本理论 色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组

12、分要达色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，到完全分离，两峰间的距离必须足够远两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。质有关。 但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中中传质和扩散行为传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从因

13、此，要从热力学和动力学热力学和动力学两方面来研究色谱行为。两方面来研究色谱行为。 在在5050年代，色谱技术发展的初期，年代，色谱技术发展的初期，MartinMartin等人把色等人把色谱分离过程比作分馏过程，并把分馏中的半经验理论谱分离过程比作分馏过程，并把分馏中的半经验理论塔板理论用于色谱分析法。塔板理论用于色谱分析法。 塔板理论把色谱柱比作一个分馏塔，塔内有若干个塔板理论把色谱柱比作一个分馏塔，塔内有若干个想象的塔板，物质在每个塔板里的两相之间达到一次分想象的塔板，物质在每个塔板里的两相之间达到一次分配平衡。经过多次这样的分配之后，最后，挥发度大的配平衡。经过多次这样的分配之后，最后，挥

14、发度大的组分和挥发度小的组分彼此分离，挥发度大的最先从塔组分和挥发度小的组分彼此分离，挥发度大的最先从塔顶（即柱后）逸出。显然这个理论并不完全符合色谱柱顶（即柱后）逸出。显然这个理论并不完全符合色谱柱的实际分离过程，色谱分离和一般的分馏塔分离有着重的实际分离过程，色谱分离和一般的分馏塔分离有着重大的差别，但是因为这个比喻形象简明，能说明一些问大的差别，但是因为这个比喻形象简明，能说明一些问题，因此几十年来一直沿用。题，因此几十年来一直沿用。 塔板理论塔板理论柱分离效能指标柱分离效能指标 塔板理论的假设：塔板理论的假设： 在每一个平衡过程间隔内，平衡可在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到；以

15、迅速达到； 将载气看作成脉动（间歇）过程；将载气看作成脉动（间歇）过程； 试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；试样沿色谱柱方向的扩散可忽略； 每次分配的分配系数相同。每次分配的分配系数相同。 塔板理论是一种半经验性理论。它用热力学的观点定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率，解释了流出曲线的形状，并提出了计算和评价柱效高低的参数,有一定的开创性。但是，色谱过程不仅受热力学因素的影响，还与分子的扩散、传质等动力学因素有关，塔板理论只能定性地给出板高的概念，却不能解释板高受哪些因素影响；也不能说明为什么在不同的流速下，可以测得不同的理论塔板数，因而限制了它的应用。 1956年荷兰学者van Deemter（

16、范第姆特）等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论速率理论。他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。van Deemter方程的数学简化式为H = A + B/u + Cu 式中u为流动相的线速度(线速度=柱长/死时间)；A、B、C为常数，分别代表涡流扩散系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。速率理论速率理论影响柱效的因素影响柱效的因素 1 1、涡流扩散项涡流扩散项在填充柱中，由于受到固定相颗粒的阻碍，在填充柱中，由于受到固定相颗粒的阻碍，组份在迁移过程中随流动相不断改变方向，形成紊乱的组份在迁移过程中随流

17、动相不断改变方向，形成紊乱的“涡涡流流”：从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀性：从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀性同一组分运行路线长短不同同一组分运行路线长短不同流出时间不同流出时间不同峰形展峰形展宽。宽。 A A与填充物的平均直径与填充物的平均直径d dp p的大小和填充不均匀因子的大小和填充不均匀因子有关。有关。 2 2、分子扩散项分子扩散项B/uB/u（纵向扩散项）：纵向扩散项）：纵向分子扩散是由于浓度纵向分子扩散是由于浓度梯度引起的。当样品被注入色谱柱时，它呈梯度引起的。当样品被注入色谱柱时，它呈“塞子塞子”状分布。状分布。随着流动相的推进，随着流动相的推进， “塞子

18、塞子”因浓度梯度而向前后自发地扩因浓度梯度而向前后自发地扩散，使谱峰展宽。散，使谱峰展宽。 是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子，它反映了固定相的几何形状对分子扩散的阻碍情况。子，它反映了固定相的几何形状对分子扩散的阻碍情况。 D D为组分在流动相中扩散系数（为组分在流动相中扩散系数（c mc m2 2ss-1-1）。）。 DgDg气相扩散系数比液相扩散系数气相扩散系数比液相扩散系数DmDm大的多（约大的多（约10105 5倍）倍） 3 3、传质阻力项、传质阻力项CuCu：由于浓度不均匀而发生物质迁移过程称由于浓度不均匀而发生物质迁移过

19、程称为传质，影响该过程进行速度的阻力为传质阻力。传质为传质，影响该过程进行速度的阻力为传质阻力。传质阻力系数包括两部分，即阻力系数包括两部分，即m m+C+Cs s两项组成。两项组成。 C Cm m流动相传质阻力系数，组分从流动相移动到固定相流动相传质阻力系数，组分从流动相移动到固定相表面进行表面进行两相之间的质量交换两相之间的质量交换时所受到的阻力，质量交时所受到的阻力，质量交换慢，引起色谱峰变宽。换慢，引起色谱峰变宽。 CsCs固定相传质阻力系数，即组分从固定相传质阻力系数，即组分从两相界面移动到固两相界面移动到固定相内部定相内部，达分配平衡后，又返回到两相界面，在这过，达分配平衡后，又返

20、回到两相界面，在这过程中所受到的阻力为固定相传质阻力。程中所受到的阻力为固定相传质阻力。气相色谱气相色谱 uDskkdDdkkuDdHfgpgp)1 (32)1 (01. 02222222+=gl液相色谱液相色谱 uDduDduDdHsfmpmp2222gl+=GCGC（a a）uu有一最低点有一最低点u u最佳最佳；u u小小或或u u大大，H H都大；都大；LCLC（b b）uu没有最低点；没有最低点； u u大大，H H增大不多，因此可用较高增大不多，因此可用较高的流速，提高分析速度。的流速，提高分析速度。H Hu uGCGC（a a）LCLC（b b）LCLC和和GCGC的的H-uH-

21、u图图 分离度分离度总分离效能指标总分离效能指标 分离度分离度( (分辨率、分辨率、分辨度分辨度) )是一个综合性指标是一个综合性指标, ,既能反映柱效能又能反映选择性的指标，称总分既能反映柱效能又能反映选择性的指标，称总分离效能指标。它定义为相邻两组分色谱峰保留值离效能指标。它定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，即之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，即21)1()2(21YYttRRR+=R=1.5R=0.75R=1.0响应信号保留时间保留时间 t, min分离度与柱效能、选择性的关系分离度与柱效能、选择性的关系 121 , 2RRttr=22/1)(54.

22、5WtnR=2/ )(1212bbRRWWttR+=a a：柱效项：柱效项：通过增加柱长提高分离度。然而，分析时间也相通过增加柱长提高分离度。然而，分析时间也相应增加，且峰宽也展宽！为提高柱效，用应增加，且峰宽也展宽！为提高柱效，用减小塔板高度减小塔板高度H的方法比增加柱长更有效。的方法比增加柱长更有效。c c：柱容量项：柱容量项： 一般一般2 2 。对于对于GCGC，通过通过提高温度提高温度，以，以改进分离度；对于改进分离度；对于LCLC，改变流动相的组成改变流动相的组成，以改进分离度，它，以改进分离度，它对对LCLC的分离能起到立竿见影的效果。的分离能起到立竿见影的效果。k 对于相邻的难分

23、离组分，由于它们的分配系数对于相邻的难分离组分，由于它们的分配系数 K 相差小，相差小，可合理假设可合理假设 ，Y1 Y2=Y，可导出可导出R与与n理理(n有效有效)、 和和 的关系：的关系：kkkk=21114221 , 21 , 22+=kknRgg理1 , 2gb b：选择性项：选择性项：增大增大 是提高分离度的最有效方法，是提高分离度的最有效方法，增大增大 的的最有效方法是最有效方法是选择合适的固定液选择合适的固定液。1 , 2g1 , 2g以以n有效有效表示，则有：表示，则有：21 , 21 , 222)1(16=ggRn有效1 , 21 , 2214gg=有效nR4 4-4 -4

24、色谱定性和定量分析色谱定性和定量分析 在了解样品的来源、性质、分析目的的基础上，对样品组成在了解样品的来源、性质、分析目的的基础上，对样品组成作初步的判断，再利用保留值确定各色谱峰所代表的化合物；作初步的判断，再利用保留值确定各色谱峰所代表的化合物； 色谱法与其它仪器分析方法联用（如：色谱法与其它仪器分析方法联用（如：GC-MS)GC-MS)目前解决复目前解决复杂混合物中未知物定性的最有效工具。杂混合物中未知物定性的最有效工具。一、定性分析一、定性分析确定每个色谱峰所代表的化合物确定每个色谱峰所代表的化合物 不同物质在同一色谱条件下，可能具有相似或相同的保留值，不同物质在同一色谱条件下，可能具

25、有相似或相同的保留值，即保留值并非专属的；即保留值并非专属的；2 2. .相对保留值法：相对保留值相对保留值法：相对保留值r r2121仅与柱温和固定液性质有仅与柱温和固定液性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。据，可以用来进行定性鉴定。3 3. .保留指数定性法保留指数定性法：保留指数又称为柯瓦（保留指数又称为柯瓦（KovtsKovts）指数，指数，它表示物质在固定液上的保留行为，它表示物质在固定液上的保留行为，是目前使用最广泛并被是目前使用最广泛并被国际上公认的定性指标国际上公认的定性指标。它

26、具有重现性好、标准统一及温度。它具有重现性好、标准统一及温度系数小等优点。系数小等优点。4.4.与其它分析仪器联用的定性方法与其它分析仪器联用的定性方法（如：（如：GC-MSGC-MS等等) )1.1.利用保留时间定性：此方法要求操作条件稳定、一致，必利用保留时间定性：此方法要求操作条件稳定、一致，必须严格控制操作条件，尤其是流速。须严格控制操作条件，尤其是流速。不适用于不同仪器上获不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。得的数据之间的对比。二、定量分析二、定量分析 气相色谱定量分析是根据检测器对溶质产生气相色谱定量分析是根据检测器对溶质产生的的响应信号与溶质的量成正比响应信号与溶质的量成正比

27、的原理，通过色谱的原理，通过色谱图上的峰面积或峰高，计算样品中溶质的含量。图上的峰面积或峰高，计算样品中溶质的含量。 m mi i被测组分被测组分i i的质量，的质量，f fi i 比例系数，定量校正因比例系数，定量校正因子子A Ai i、h hi i被测组分的峰面积及峰高被测组分的峰面积及峰高iiiiiihfmAfm =或v 峰面积的测量峰面积的测量 对于对称的色谱峰对于对称的色谱峰 A=1.065hA=1.065hY Y1/21/2 对于非对称的色谱峰对于非对称的色谱峰 A=h(YA=h(Y0.150.15+Y+Y0.850.85)/2)/2v 定量校正因子定量校正因子 绝对校正因子绝对校

28、正因子 相对校正因子相对校正因子siisssiisiimAmAAmAmfff=定量方法定量方法nniiniiifAfAfAfAmmmmmmw+=+=221121 归一化法：所有出峰组分的含量之和按归一化法：所有出峰组分的含量之和按100%100%计。计。mfAmfAmmwsssiiii= 内标法内标法准称样品准称样品m m（含被测组分含被测组分m mi i ）+ +准称纯物质作内标物准称纯物质作内标物m ms sA Ai iA As s色谱分离色谱分离 外标法（外标法（标准曲线法）标准曲线法）:对内标物的要求：对内标物的要求： 内标物应是样品中不存在的纯物质；内标物应是样品中不存在的纯物质； 内标物的峰位置应尽量靠近被测组分的峰，或内标物的峰位置应尽量靠近被测组分的峰，或位于几个被测物色谱峰的中间并与这些色谱峰位于几个被测物色谱峰的中间并与这些色谱峰完全分离；完全分离； 内标物的质量应与被测物质的质量接近，能保内标物的质量应与被测物质的质量接近，能保持色谱峰大小差不多。持色谱峰大小差不多。例题1： 已知物质已知物质A和和B在一根在一根30.00 cm长的柱上的保留时间分别长的柱上的保留时间分别为为16.40 min和和17.63 min。不被保留组分通过该柱的时间为不被保留组