研究性学习论文参考

1、不同冷冻保护剂对小鼠胎儿成纤维细胞冷冻后成活率的影响（姓名）摘要：本实验以处于对数生长期的小鼠胎儿成纤维细胞为材料，采用慢速冷冻、快速融解的冷冻技术，比较二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、甘油（GL）这三种冷冻保护剂分别与血清的不同配置组合以及这三种保护剂之间的不同配置组合对小鼠胎儿成纤维细胞冷冻后成活率的影响。结果发现：以10DMSO20EG的冷冻保护剂冷冻效果最好，解冻后细胞的成活率显著高于其他组合类型的冷冻保护剂。关键词：不同冷冻保护剂 小鼠胎儿成纤维细胞 成活率胚胎冷冻保存就是将动物的早期胚胎，采用特殊的保护剂和降温措施进行冷冻，使其在-196的液氮中停止代谢或者减弱到足够小的程

2、度，但又不失去升温后恢复代谢的能力，从而能长期保存胚胎的一种生物技术。自1972年Whittingham首次报道植入冷冻小鼠胚胎获得正常后代以来，冷冻技术已经在多种细胞领域中取得成功。近几十年来，丙二醇、二甲基亚砜和甘油结合蔗糖已经广泛应用在哺乳动物及人类胚胎的冷冻保存中1。成纤维细胞具有较强的分裂增生能力，适应性强且性状稳定，是研究动物克隆最常用的细胞类型。本实验通过对小鼠胎儿成纤维细胞的培养，建立小鼠胎儿成纤维细胞系，并用DMSO、EG和GL作为冷冻保护液，添加10%-30%的FCS的DMEM为基础冻存液保存成纤维细胞，筛选合适小鼠胎儿成纤维细胞冷冻保存的保护液组分，为动物细胞核移植、转基

3、因等提供核供体材料。1 材料和方法1.1 材料与仪器实验材料：小鼠胎儿成纤维细胞实验试剂：DMEM培养液、20胎牛血清（FBS）、分析纯二甲基砜（DMSO）或甘油、消化液（DMEM+0.25胰蛋白酶+0.02EDTA）、培养液(DMEM+10胎牛血清),0.1%台盼蓝溶液,10%EG和10%GL冷冻剂实验器材：超净工作台、CO2培养箱、离心机、高压灭菌锅、电热干燥箱、倒置显微镜、低温冰箱、酒精灯、分析天平、吸管、25ml卡氏培养瓶、无菌60mm培养皿、烧杯（100ml）、眼科剪、眼科镊、不锈钢筛（100m）、离心管（100ml）、细胞冻存管、血细胞计数板。1.2 实验方法与步骤 小鼠胎儿成纤维

4、细胞的获取 处死孕鼠（引颈法），剪开腹腔，取出胎儿，去头、尾、内脏，用酶消化的方法，用DMEM+0.25胰蛋白酶+0.02EDTA消化液2-3ml消化3-5min并收集细胞，2500r/min离心5min弃上清液，用DMEM洗涤液清洗细胞1-2次。 细胞的稀释与分装组织块培养法和消化法接种，3天后更换培养液；再过三天，进行细胞的传代培养，并于三天后更换培养液；再3天后，冷冻保存操作：取出传代细胞，去除培养液。1. 2. 3 冻存将细胞冻存管用棉花包好放入泡末小盒,固定好后放入-70冰箱中，冻存一个星期。1. 2. 4 解冻将冻存取出,立即投入盛有38温水的烧杯中,不时摇动,使其尽快解冻。1.

5、2. 5 洗涤从水浴中将冻存管取出,用乙醇消毒冻存管后,打开螺帽,用吸管吸出细胞悬液,注入离心管并立即加入洗涤液至10ml,混匀后2500r/min离心5min,弃上清液,加入培养液至6 ml并混匀。 接种加入适当培养液稀释并调整细胞浓度到5*105 /ml,以每瓶3ml接种到培养瓶中,置37、5%二氧化碳、饱和湿度下培养,根据细胞生长情况及时更换培养液以及传代。并在一个星期之后镜检观察细胞生长情况 镜检计数a) 取上述细胞悬液100uL，滴加0.1%台盼蓝染液，染色1015min。b) 用血细胞计数板计数，镜检四个大方格，记录活细胞数与细胞总数，并计算其戚率，评价冷冻效果。2. 结果与分析2

6、.1 实验结果冷冻剂血清浓度平均存活率 10 DMSO10FCS63.02%20FCS67.27%30FCS63.34%10 GL10FCS36%20FCS39.6%30FCS42%10 EG10FCS38.07%20FCS40.27%30FCS37.82%5DMSO5EG10FCS52%20FCS48.54%30FCS47.28%5DMSO5GL10FCS49%20FCS33%30FCS51%细胞存活率=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）*100%2.2 10DMSO与不同的配置比例血清的冷冻剂对细胞冷冻效果的影响 10DMSO与血清不同配置比例的冷冻剂对细胞冷冻效果的影响血清浓度存活率

7、10%FCS63.02%20%FCS67.27%30%FCS63.34%从左表可以看到：存活率并不与血清浓度成正比的关系，其中血清浓度为10%和30%时，两者的成活率差不多，而当血清浓度为20%时，其存活率最高。且在本实验中，10DMSO20FCS的冷冻保护剂冷冻效果最好。 2.3 10GL与不同的配置比例血清的冷冻剂对细胞冷冻效果的影响 10GL与血清不同配置比例的冷冻剂对细胞冷冻效果的影响血清浓度存活率10%FCS36%20%FCS39.6%30%FCS42%从左表可以看到：当以10GL为保护剂时，其效果随着血清浓度的升高而升高。存活率随着血清浓度的升高而升高，呈正比关系。不过起效果与DM

8、SO做保护剂时相比却要低很多。 2.4 10EG与不同的配置比例血清的冷冻剂对细胞冷冻效果的影响10EG与血清不同配置比例的冷冻剂对细胞冷冻效果的影响血清浓度存活率10%FCS44.6820%FCS42.9030%FCS34.46根据左表数据，当用EG做保护剂时，其存活率随着血清浓度的增加而呈现下降趋势，呈反比关系。其效果比用DMSO要差，和用GL的效果差不多。2.5 5DMSO5EG与不同的配置比例血清的冷冻剂对细胞冷冻效果的影响5%DMSO+5%EG与血清不同配置比例的冷冻剂对细胞冷冻效果的影响血清浓度存活率10%FCS52%20%FCS48.54%30%FCS47.28%根据左表的数据，

9、以5DMSO5EG混溶并配以不同比例的血清形成的冷冻保护剂，效果比单独的10EG组和10GL组好，不过却比单独的10DMSO组要差。而且其效果随着血清浓度的增加而呈现下降趋势。2.6 5DMSO5GL与不同的配置比例血清的冷冻剂对细胞冷冻效果的影响5%DMSO+5%GL与血清不同配置比例的冷冻剂对细胞冷冻效果的影响血清浓度存活率10%FCS49%20%FCS33%30%FCS51%根据左表的数据，以5DMSO5GL混溶形成的冷冻保护剂对细胞成活率的影响和用5DMSO5EG的效果差不多，只不过当血清浓度为20%时其效果显得特别的低。这可能与实验操作的规范性有关。3. 讨论1. 超低温冷冻对细胞的

10、损害主要是细胞内冰晶的形成和细胞外所产生的溶液效应。细胞若在不加低温保护剂而直接进行冻存时，细胞内外环境中的水会形成冰晶，导致细胞发生一系列变化，如机械损伤、电解质升高、渗透压升高或改变、脱水等等，最终导致细胞死亡。但向细胞培养液加入冷冻保护剂后，由于DMSO等属于小分子物质，且无明显毒性，在细胞悬液完全凝固之前渗透到细胞内，在细胞内产生一定的摩尔浓度，在缓慢冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶。另外，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过度脱水皱缩，达到保护细胞的目的。2. 本实验结果表明，DMSO是一种较适合冻存小鼠胎儿成纤维细胞的冷冻保护剂，而且当它以10DMSO

11、+20FBS这一配置比例时，为较适合的浓度。可能是因为在这几种冷冻保护剂中，DMSO的渗透性强于其他两种保护剂，而且其毒性比其他两种保护剂的要低，有利于冷冻细胞的存活。3. 不同的冷冻剂有不同的冷冻效果，其中细胞对EG耐受能力好，渗透速度明显快于PROH、DMSO以及GL，从而EG降低其对细胞造成的渗透性损害，并且能缩短解冻过程中清除保护剂的时间。DMSO也易渗入细胞内部，使细胞不至于强烈脱水造成损伤，但常温下有弱毒性，使用时需在低温下操作。GL分子量低、毒性小、渗透性差，很容易形成玻璃化;但GL太低的膜通透性构成GL作为冷冻保护剂最大的弱点。目前对冷冻剂的选择一般考虑是否有利于细胞短时间内脱

12、水，减少细胞内冰晶的形成，目前普遍认为10DMSO或20DMSO添加10FBS冷冻保存效果最好。可是在本实验中，10DMSO+20FBS这一配置比例时，为最适合的浓度，不过和10DMSO+10FBS这一配置相差不是很大。4.加入的血清主要是在细胞解冻时通过补给细胞营养、增殖因子、稳定培养液pH及营造高浓度蛋白状态（10%FBS约为 2.5mg/ml 的蛋白质），为细胞提供复苏时所需要的物质与能量。5. 影响细胞复苏后存活率的因素有2个方面:细胞冻存程序和冷冻保护剂种类，因而除了选择合适的冷冻剂还应采用合理的冷冻程序，同时在解冻时候解冻时要遵循快融的原则。6冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。常常配制成一定浓度的溶液作为冷冻保护液。一般来讲，只有红细胞、大多数微生物和极少数有核的哺乳类动物细胞悬浮在不加冷冻保护剂的水或简单的盐溶液中，并以最适的冷冻速率冷冻保存,可以获得活的冻存物。但对于大多数有核哺乳类动物细胞来说，在不加冷冻保护剂的情况下，无最适冷冻速率可言，也不能获得活的冻存物。而加入甘油冷冻保护剂进行