蛋白相互作用Pull-Down实验#(优选.)

1、蛋白相互作用Pull-Down实验实验原理：Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。是 确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。Pull-Down实验可用来检测已知的蛋白相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。用作诱饵的蛋白是重组蛋白，会含有一个用于纯化的亲和标签。这个融合标 签就是用于Pull-Down实验的基础。最常见的标签为谷胱甘肽 S-转移酶（GST） 和多组氨酸（6和is）。其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲和 配体（如 皿2+和Co2+）。Ptiase 1In vitro Proy Protein Synlhosis(TNT*T7S

2、ySl«n)PhasB 2Immobilization of Bair tG ST-fusion)Prolein onto ManeGST Panides爭I &WaihWashEluteJ|gst|-C + G>proy prntGin detociedFigur* 1 Overview of the MjgneGST Pall-Down System protocoL P h Prey Protein, M = MAgneGST PjtftKk.实验准备：实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶(镍离子琼脂糖凝胶) 、离心机、 实验材料：表达的含标签的纯化蛋白、细胞裂解液实验试

3、剂： Binding Buffer/Washing Buffer: 4.2mM Na2HPO4、2mM KH 2PO4、 140mM NaCl 、10mM KClSDS loading Buffer: 50mM Tris-CI(pH6.8)、2%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、 10mM DTT裂解缓冲液：20mM Tris-CI(pH8.0)、200mM NaCl、 1mM EDTA (pH8.0)、0.5% Nonidet P-40 使用前加入加入蛋白酶抑制剂。 (蛋白酶抑制剂： 2ug/ul 抑肽酶 (aprotinin )、1ug/ul 白胃素( leupeptin )、0.7ug

4、/ml 胃酶抑素( pepstatin)、25ug/ml 苯甲磺酰 氟( PMSF)实验方法： 方法一：1 、预清除细胞裂解液：将细胞裂解液与50ul的50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和25ug GST在4C混 合孵育 2h。离心机12,000g在4°C离心2min。 将上清转移至新的离心管中。2、探测细胞裂解液 两个含等量预清除细胞裂解液及 50ul 谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。 在 一管中加约10ug的GST蛋白，另一管中加约10ug的GST融合探针蛋白。 两个反应中加入的探针和对照蛋白质的量应该是等摩尔的。将离心管在 4C 翻转混合孵育 2h。最大速度在4C离心样品2min。

5、在新的微量离心管中收集上清。用1ml冰冷的裂解液洗球珠。在离心机上以最大速度离心1ml。弃去上清。重复洗三次。加入50ul 20mmol/L的还原型谷胱甘肽到球珠中，洗脱 GST融合蛋白及任何与其结合的蛋白质。在离心机上最大速度离心 2min将洗脱蛋白质与等体积的2WDS-PAGE上样buffer混合。3、检测相互作用蛋白质将样品煮沸4min，进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。方法二：1、5ug目的GST融合探针蛋白和GST蛋白分别和谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠 在4C孵育结合30min。2、结合 GST 融合探针蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠与 100ul 细胞裂解液 结合在4C作用4h。3、300

6、0rpm在4C离心5min，除去上清。4、 用洗涤缓冲液重悬谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠，3000rpm在4C离心5min, 除去上清，重复 5 次。5、取谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠进行 SDS-PAGE电泳分析。方法三：实验试剂：PBS( 140mM NaCI、2.7mM KCI、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4) Elution Buffer: 50mM Tris-CI(pH8.0)、10mM 还原型谷胱甘肽 0.154g溶解到 50ml 50mM Tris-Cl(pH8.0)中配制 Elution Buffer。1 、细胞裂解取 1ml 细菌培养液离心去上清，加 200ul 细胞

7、裂解液到菌丸，在室温下重 悬并轻柔的混匀。将其在室温下晃动孵育 20-30min。2、固定 GST 融合蛋白到柱子上将谷胱甘肽琼脂糖凝胶颠倒混匀后取 20ul到1.5ml离心管中，小心去除上 清，加250ul Bin di ng Buffer或wash Buffer到凝胶中，混匀。重复洗3次以上。平衡好的凝胶用 100ul Binding Buffer 或 wash Buffer 重悬。加 200ul 含 GST 融合蛋白的细菌裂解液，在旋转的台子上室温下孵育30min。小心移去上清，(保存以便分析，)将 250ul Binding Buffer 或 wash Buffer 加到凝胶中，轻柔混

8、匀，在室温下孵育5min。小心移去上清。加入250ulBinding Buffer 或 Washing Buffer 再次清洗，将凝胶用 20ul Binding Buffer 或 wash Buffer 重悬。3、捕获猎物蛋白将 5ul 固定 GST 融合蛋白的凝胶中加入 20ul 含猎物蛋白的溶液，将 155ul Binding Buffer 或 wash Buffer 和 20ul 10%BSA 加入凝胶中，在室温下旋转孵 育1h。移去上清。将 400ul Binding Buffer 或 wash Buffer 加入凝胶中， 轻柔混匀， 在室温下孵 育5min，移去上清。加400ul

9、Binding Buffer或wash Buffer再次清洗凝胶。 小心移去上清。分析：加20ul SDS-PAGE loading Buffer,在室温下混合5min。取出上清用于 分析。His Pull-Down 方法实验试剂：Binding Buffer: 20mM Tris-CI(pH8.0)、150mM NaCI、20mM 咪唑 Elution Buffer: 20mM Tris-Cl(pH8.0) 、 300mM NaCl、 500mM 咪唑 实验步骤：1、结合蛋白裂解后，经0.45um滤膜过滤，2、与Ni-NTA树脂(1ml蛋白裂解液上清结合5ul树脂)4C混合孵育3h。3、待树

10、脂沉淀后用 1 0倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液洗去杂蛋白。4、用 6 倍柱体积镍柱洗脱目的蛋白。5、纯化后的蛋白用PBS和超纯水透析，冻干。6、SDS-PAGE电泳分析7、纯化的蛋白与 Ni-NTA 树脂冰浴作用 2h，8、10 倍柱体积洗涤缓冲液洗涤，9、然后加入过量 100ug/ml 蛋白溶液，冰浴作用 2h，10、用 10 倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液清洗，11 、加入 1 倍柱体积洗脱缓冲液洗脱，12、洗脱蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定。13、 阴性对照为结合蛋白溶液加入Ni-NTA树脂中冰浴作用2h。10倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液清洗，加入 1 倍柱体积洗脱缓冲液洗脱，注意事项：1 、所有过柱的液体都要经过 0.45um 或 0.22um 的滤膜。2、平衡柱子：2.1 用 3-5 个柱体积蒸馏水洗柱2.2 用 3-5 个柱体积的 binding buffer 平衡柱子。3、洗柱：如谷胱甘肽琼脂糖凝胶的柱子失去结合能力，需要洗去柱子上的杂质3.1除去变性物质，用2个柱体积的的6M盐酸胍洗柱子，然后用5个柱体积 的 PBS 洗柱3.2除去疏水性物质， 用 3-4个柱体积的 7