生物转化常见反应类型

1、第三章第三章 介绍生物转化的常见反应类型介绍生物转化的常见反应类型以甾体化合物的生物转化为例进行阐述以甾体化合物的生物转化为例进行阐述 甾体化合物和甾体药物简介 甾体化合物结构 甾类化合物常见种类甾体化合物和甾体药物简介甾体化合物和甾体药物简介 1952年，美国普强药厂的年，美国普强药厂的Morray和和Pereroon首次利用黑根霉将黄体同转化为首次利用黑根霉将黄体同转化为11 黄体酮，人们开始认识到甾体微生物转黄体酮，人们开始认识到甾体微生物转化在甾体药物生产中的重要性。化在甾体药物生产中的重要性。 微生物几乎对甾体的每个位置都能进行转微生物几乎对甾体的每个位置都能进行转化。化。 几种重要

2、的甾体微生物转化发应如羟化，几种重要的甾体微生物转化发应如羟化，脱氢成为工业上生产甾体激素及其类似物脱氢成为工业上生产甾体激素及其类似物的重要手段的重要手段甾体化合物甾体化合物 一类含有环戊烷多菲核的化合物 在甾核的第10，13位常常含有角甲基；在3，11,17位，可能有羟基、酮基；A，B环有部分双键；17位有不同的测链。目前甾体微生物转化中受到人们广泛关注的领域目前甾体微生物转化中受到人们广泛关注的领域将微生物基因工程的新技术应用于甾体微将微生物基因工程的新技术应用于甾体微生物转化生物转化提高水不容性底物的溶解度提高水不容性底物的溶解度细胞和酶的固定化以利于酶的重复经济利细胞和酶的固定化以利

3、于酶的重复经济利用用发展经济有效的产物连续回收方式发展经济有效的产物连续回收方式将环糊精等应用于培养基以提高产量将环糊精等应用于培养基以提高产量甾体化合物结构甾体化合物结构菲环戊烷多氢菲甾体化合物编号甾体化合物编号2345167891413121115环戊烷多氢菲101617甾类化合物常见种类甾类化合物常见种类 动物组织中动物组织中：胆固醇、胆酸、皮脂素、胆固醇、胆酸、皮脂素、皮脂醇（氢化可的松）、皮脂酮等皮脂醇（氢化可的松）、皮脂酮等 睾酮、雄酮、孕酮、雌二醇等生殖腺激睾酮、雄酮、孕酮、雌二醇等生殖腺激素。素。 植物中植物中：薯芋皂豆甾醇薯芋皂豆甾醇 酵母细胞酵母细胞：麦角固醇麦角固醇甾体化

4、合物编号甾体化合物编号2345167891413121115环戊烷多氢菲101617甾类化合物常见种类甾类化合物常见种类 动物组织中动物组织中：胆固醇、胆酸、皮脂素、胆固醇、胆酸、皮脂素、皮脂醇（氢化可的松）、皮脂酮等皮脂醇（氢化可的松）、皮脂酮等 睾酮、雄酮、孕酮、雌二醇等生殖腺激睾酮、雄酮、孕酮、雌二醇等生殖腺激素。素。 植物中植物中：薯芋皂豆甾醇薯芋皂豆甾醇 酵母细胞酵母细胞：麦角固醇麦角固醇甾体类激素药甾体类激素药 肾上腺皮脂激素类肾上腺皮脂激素类 可的松、强的松、氢化可的松可的松、强的松、氢化可的松 功能：功能：抗炎、抗毒、抗过敏抗炎、抗毒、抗过敏 对风湿、类风湿性关节炎、红斑狼疮等

5、有治疗对风湿、类风湿性关节炎、红斑狼疮等有治疗作用。作用。 生殖腺激素生殖腺激素 孕酮、雌酮孕酮、雌酮 功能：功能：调节内分泌调节内分泌 人工合成避孕药人工合成避孕药 长效孕酮等长效孕酮等微生物在甾体药物生产中的应用微生物在甾体药物生产中的应用 主要分为两大类主要分为两大类 将天然原料转化为生产甾体化合物的普通中间体。将天然原料转化为生产甾体化合物的普通中间体。 如植物皂角苷羟化生成皂角苷配基如植物皂角苷羟化生成皂角苷配基 降解甾醇边链生成有用的甾体化合物中间体，降解甾醇边链生成有用的甾体化合物中间体， 雄甾雄甾4烯烯3，17二酮；二酮； 雄甾雄甾1，4二烯二烯3，17二酮。二酮。 转化成特殊

6、的甾体化合物的中间体，以生产我们所转化成特殊的甾体化合物的中间体，以生产我们所需要的产物。需要的产物。 如：甾体如：甾体11 ，11 及及16 羟化，羟化， 1 脱氢脱氢 甾体边链降解甾体边链降解微生物对甾体化合物的转化微生物对甾体化合物的转化 微生物对甾体化合物的转化多种多样微生物对甾体化合物的转化多种多样 它们对甾体的每一位置上的原子或基团都有可能它们对甾体的每一位置上的原子或基团都有可能进行生物转化。进行生物转化。 其反应类型主要有氧化、还原、水解、酯化等等。其反应类型主要有氧化、还原、水解、酯化等等。 包括甾体母核上和测链上的某个位置的羟基化、包括甾体母核上和测链上的某个位置的羟基化、

7、酮基化、环氧化、脱氢形成双链、芳香化、开环、酮基化、环氧化、脱氢形成双链、芳香化、开环、形成内酯、侧链断裂、降解。形成内酯、侧链断裂、降解。羟基化反应羟基化反应是甾体微生物转化中最重要的反应。化学法除了较容易在C17引入羟基外，在其他位置都很难引入羟基。 微生物对甾体的羟基化作用微生物对甾体的羟基化作用 微生物能在甾体的任何位置进行羟基化发应，微生物能在甾体的任何位置进行羟基化发应，也可在非甾类有机分子上羟基化。也可在非甾类有机分子上羟基化。 简单的羟基化作用是在甾体的某个位置上引入简单的羟基化作用是在甾体的某个位置上引入O原子。原子。 在甾核上至少有在甾核上至少有21个位置可以发生。个位置可

8、以发生。 11位羟基化作用最重要，位羟基化作用最重要，11位位C的氧化对可的的氧化对可的松药物疗效是不可缺少的，松药物疗效是不可缺少的，11 ，11 。 除除11位位C进行羟基化反应外，进行羟基化反应外，9 ，14 ，16 的羟基化，在制备甾体药物时，生产皮质甾类的羟基化，在制备甾体药物时，生产皮质甾类化合物及其类似物。化合物及其类似物。进行甾体羟基化作用的微生物进行甾体羟基化作用的微生物转化物质转化物质作用位置作用位置微生物代表微生物代表孕酮孕酮11 11 黑根霉、黑曲霉、腊状杆菌等黑根霉、黑曲霉、腊状杆菌等弯曲孢霉弯曲孢霉化合物化合物S11 11 黑根霉、黑曲霉、焦曲霉构巢曲黑根霉、黑曲霉

9、、焦曲霉构巢曲霉霉假单孢杆菌、弗氏链霉菌、梨头假单孢杆菌、弗氏链霉菌、梨头霉霉11脱氧皮脂酮脱氧皮脂酮11 弯月弯孢霉弯月弯孢霉雌二醇雌二醇16 巨大芽孢杆菌巨大芽孢杆菌羟基化反应机理羟基化反应机理羟基化反应羟基化反应由于这些酶能将一摩尔分子氧引入底物，因由于这些酶能将一摩尔分子氧引入底物，因此被定义位单氧化酶。此被定义位单氧化酶。这种细胞色素这种细胞色素p450依赖的单氧化酶存在于几依赖的单氧化酶存在于几乎所有形式的生命体中，以游离或膜结合的乎所有形式的生命体中，以游离或膜结合的形式存在。形式存在。同位素实验证明同位素实验证明甾体羟基化中存在的问题甾体羟基化中存在的问题环糊精的生理作用环糊精

10、的生理作用 Hesselink等研究：等研究： 应用环糊于分枝杆菌应用环糊于分枝杆菌甾体边链的降解。甾体边链的降解。 环糊精是一种环状寡聚糖，一般由环糊精是一种环状寡聚糖，一般由68个个葡萄糖分子通过葡萄糖分子通过 1，4糖苷键连接而成。糖苷键连接而成。 易溶于水。易溶于水。 含有疏水性空腔，可与疏水性分子结合。含有疏水性空腔，可与疏水性分子结合。 可作为几种甾体类药物的稳定剂和增溶剂可作为几种甾体类药物的稳定剂和增溶剂。环糊精的应用实例环糊精的应用实例1 Chincholkar 等研究了在等研究了在 环糊精存在时，环糊精存在时，Currularia VKMF-644对对11脱氢皮甾醇脱氢皮甾

11、醇（Reichstein S化合物，简称化合物化合物，简称化合物S）的的11 羟基化。羟基化。在底物浓度为在底物浓度为4g/L时：时： 化合物化合物S： CD1.0:0.6 氢化可的松氢化可的松的产率为的产率为7075 无无 CD： 氢化可的松的产率氢化可的松的产率为为4050环糊精的应用实例环糊精的应用实例2 GD：19去甲基去甲基13乙基雄甾乙基雄甾4烯烯3，17双酮双酮 经经Penicillium raistrickii进行进行15 羟羟基化基化口服避孕药口服避孕药5D十十八甲基炔诺酮（八甲基炔诺酮（gestodene）的重要）的重要中间体。中间体。 Schlosser等研究表明：在等研

12、究表明：在 环糊精环糊精存在时，菌株或其固定化细胞对存在时，菌株或其固定化细胞对CD的的15 羟基化作用，与以甲醇做溶剂比较，羟基化作用，与以甲醇做溶剂比较，其转化率都能明显提高其转化率都能明显提高。环糊精作用环糊精作用 环糊精有利于提高甾体底物溶解度环糊精有利于提高甾体底物溶解度 真菌能以真菌能以 环糊精作为环糊精作为C源源其他重要的羟基化反应其他重要的羟基化反应 地索高诺酮（地索高诺酮（destogestrel） 新型避孕药（荷兰新型避孕药（荷兰Organon公司推出）公司推出） 作用：月经周期控制好，副作用少，避孕可靠作用：月经周期控制好，副作用少，避孕可靠 我国研究：上海医科大学史纪平

13、我国研究：上海医科大学史纪平 19去甲基去甲基13乙基雄甾乙基雄甾4烯烯3，17双双酮酮11 羟基化羟基化（金龟子绿僵菌）形成关键（金龟子绿僵菌）形成关键中间体中间体 简化合成路线，降低副反应。简化合成路线，降低副反应。 底物：底物：0.2% 转化率：转化率：36甾体的边链降解甾体的边链降解侧链降解侧链降解 微生物对甾体侧链的降解，解决了天然甾体微生物对甾体侧链的降解，解决了天然甾体化合物作原料合成甾体激素的问题，为利用化合物作原料合成甾体激素的问题，为利用原价的原料开辟了新的途径。原价的原料开辟了新的途径。 常见微生物有：常见微生物有： 简单节杆菌简单节杆菌 球形芽孢杆菌球形芽孢杆菌 玫瑰芽

14、孢杆菌玫瑰芽孢杆菌 淡紫青霉淡紫青霉 藤黄诺卡氏菌藤黄诺卡氏菌 甾体边链降解甾体边链降解 甾体母核降解甾体母核降解3 羟基羟基5甾醇甾醇 9 羟基化，羟基化，1，2脱氢脱氢3酮酮4化合物化合物 微生物种类不同微生物种类不同1，2脱氢，脱氢，9 羟基化羟基化氧 化 甾体边链降解甾体边链降解 采用类似脂肪酸采用类似脂肪酸 氧化的氧化过程，最后形氧化的氧化过程，最后形成成C17酮甾体。酮甾体。选择性边链降解问题选择性边链降解问题 选择性边链降解策略（选择性边链降解策略（3） 辅助基因工程辅助基因工程 提高边链降解的产率策略提高边链降解的产率策略选择性甾体边链降解措施选择性甾体边链降解措施1 对甾醇进

15、行结构改造，从而阻止酶对母核的降对甾醇进行结构改造，从而阻止酶对母核的降解解 例如：例如：1965 Sih等等 将胆固醇先行改造为将胆固醇先行改造为19羟基羟基衍生物衍生物 再经一步微生物转化为再经一步微生物转化为A环芳香化的雌酚酮。环芳香化的雌酚酮。 选择性甾体边链降解措施选择性甾体边链降解措施2 加入酶抑制剂，抑制母核降解关键酶如：加入酶抑制剂，抑制母核降解关键酶如：C 1，2脱脱氢酶和氢酶和9 羟化酶。羟化酶。 如：如： Ni Co Pb Se 8羟基喹啉应用于多种分枝杆菌对胆固醇的选羟基喹啉应用于多种分枝杆菌对胆固醇的选性边链降解性边链降解 金属鳌合剂金属鳌合剂 2，2双联吡啶双联吡啶

16、 抑制母核降解抑制母核降解选择性甾体边链降解措施选择性甾体边链降解措施3 对菌株进行诱变，产生仅降解甾醇侧链的突变株对菌株进行诱变，产生仅降解甾醇侧链的突变株例如：例如： 原始菌株经诱变为原始菌株经诱变为 诱变菌株诱变菌株Mycobacterium sp，NRRL-B3683 不加抑制剂，便产生雄甾不加抑制剂，便产生雄甾1，4二烯二烯3，17二酮（二酮（ADD） 再诱变得再诱变得Mycobacterium sp，NRRL-B3805， 无无C 1，2脱氢酶脱氢酶 能产生雄甾能产生雄甾4烯烯3，17二酮（二酮（AD）基因工程新技术的应用基因工程新技术的应用专利：专利： Pseudomonas 菌

17、株无降解甾体的能力菌株无降解甾体的能力 将将Mycobacterium sp NRRL-3683 的的DNA导入导入Pseudomonas 菌株中获得重组菌。菌株中获得重组菌。 重组菌可在水相，一种或几种有机相中进重组菌可在水相，一种或几种有机相中进行转化反应。行转化反应。 Pseudomonas 菌株比菌株比Mycobacterium sp NRRL-3683的生长输率快的生长输率快 结果加快转化进程，降低成本结果加快转化进程，降低成本。方法方法 分离纯化分离纯化Mycobacterium sp NRRL-3683 的的DNA 整合到特定质粒载体中整合到特定质粒载体中 导入导入 噬菌体中噬菌

18、体中 用入用入 噬菌体感染噬菌体感染E.coli HB101，得，得E.coli重组子重组子 三亲杂交实现三亲杂交实现Mycobacterium sp NRRL-3683 的的DNA到到Pseudomonas 菌株得转移。菌株得转移。如何提高甾体边链降解的产率如何提高甾体边链降解的产率接触接触提高甾体边链降解速率提高甾体边链降解速率 Hesselink等研究表明：环糊精能明显增强等研究表明：环糊精能明显增强Mycobacterium sp NRRL-3683 降解胆固降解胆固醇、谷甾醇等边链生成醇、谷甾醇等边链生成AD的产率，不影响的产率，不影响细胞生长速度和细胞密度。细胞生长速度和细胞密度。

19、 当环糊精：底物浓度当环糊精：底物浓度=2:1时，微生物降解时，微生物降解边链的活性可增加边链的活性可增加1.7-3.0倍。倍。 环糊精能阻止母核的降解及产物的反馈抑环糊精能阻止母核的降解及产物的反馈抑制。制。环糊精在甾体边链降解中的环糊精在甾体边链降解中的作用总结作用总结 在甾体边链降解过程中，环糊精充当：在甾体边链降解过程中，环糊精充当： 惰性甾体增溶剂惰性甾体增溶剂 反应载体反应载体 保护剂保护剂甾体边链降的成功应用甾体边链降的成功应用 Arhna 和和Sih等研究报道以胆甾醇和等研究报道以胆甾醇和 谷甾醇为原料微谷甾醇为原料微生物转化法合成甾体药物中间体的方法。生物转化法合成甾体药物中

20、间体的方法。 采用酶抑制剂采用酶抑制剂 生化阻断变株生化阻断变株 改变细胞膜通透性等生物技术改造甾醇的结构，从而改变细胞膜通透性等生物技术改造甾醇的结构，从而选择性控制甾醇的边链降解选择性控制甾醇的边链降解成功合成中间体成功合成中间体 雄甾雄甾4烯烯3，17二酮（二酮（4 AD） 雄甾雄甾1，4二烯二烯3，17二酮（二酮（ADD） 9 羟基羟基4AD目的：工业生产性激素，利尿剂等甾体药物目的：工业生产性激素，利尿剂等甾体药物其他的甾体生物转化反应类型其他的甾体生物转化反应类型 脱氢作用脱氢作用 A环芳香环芳香脱氢作用使甾体核形成双键脱氢作用使甾体核形成双键强的松（去氢可的松）强的松（去氢可的松

21、） 是可的松经脱氢而形成的。是可的松经脱氢而形成的。 其抗炎功效比可的松高几倍。一般制备其抗炎功效比可的松高几倍。一般制备该种药物时，常常是将可的松或氢化可该种药物时，常常是将可的松或氢化可的松脱氢变为去氢可的松或去氢氢化可的松脱氢变为去氢可的松或去氢氢化可的松。的松。脱氢反应的常见微生物为脱氢反应的常见微生物为 简单节杆菌简单节杆菌 各种芽孢杆菌（蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢各种芽孢杆菌（蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌）杆菌） 镰刀霉镰刀霉 长蠕孢菌属。长蠕孢菌属。A环芳香化环芳香化 所谓所谓A环芳香化环芳香化 是指甾体是指甾体A环核上的每个环核上的每个C原子都脱氢形原子都脱氢形成双键，而变为芳香化结

22、构。成双键，而变为芳香化结构。 雌性激素的生产（雌二醇），可通过此雌性激素的生产（雌二醇），可通过此方法获得方法获得研究生物转化的几种常用方法研究生物转化的几种常用方法第四章第四章 研究生物转化的几种常用方法研究生物转化的几种常用方法 间歇培养法间歇培养法 整体细胞转化法整体细胞转化法 洗涤均丝悬浮法（静息细胞法）洗涤均丝悬浮法（静息细胞法） 孢子转化法孢子转化法 原生质体实验法原生质体实验法 遗传特性诱变法遗传特性诱变法 同位素示踪法同位素示踪法间歇培养法（间歇培养法（Batch culture)这种方法能够比较直接而简单地筛选能否具这种方法能够比较直接而简单地筛选能否具有转化某种化合物的活

23、性菌株。有转化某种化合物的活性菌株。游离的整体细胞游离的整体细胞 游离的整体细胞直接作为催化剂来制造产游离的整体细胞直接作为催化剂来制造产品的报道已经不少品的报道已经不少 在某种程度优于固定化细胞在某种程度优于固定化细胞 在生物转化酶工程中越来越受到重视在生物转化酶工程中越来越受到重视 游离整体细胞的基础研究更为重要游离整体细胞的基础研究更为重要游离整体细胞的基础研究内容游离整体细胞的基础研究内容 细胞的渗透化细胞的渗透化 酶的胞内固定化酶的胞内固定化 酶细胞在反应前后的形态变化和结构变化酶细胞在反应前后的形态变化和结构变化整体细胞转化应用举例整体细胞转化应用举例 底物：富马酸底物：富马酸 产

24、物产物L天冬氨酸天冬氨酸 生物转化酶：天冬氨酸酶（生物转化酶：天冬氨酸酶（EC4.3.1.1） 转化菌株：转化菌株：E.coli整体细胞转化研究整体细胞转化研究底物浓度细胞形态与结构催化反应速度细胞的渗透性关系培养基培养基培养方法培养方法不同底物浓度的反应速率不同底物浓度的反应速率 底物质量浓度较高时，在某一时间（底物质量浓度较高时，在某一时间（8h）前，转化速率较低，而后，反应速度加快。前，转化速率较低，而后，反应速度加快。 对底物富马酸盐的转化彻底。（对底物富马酸盐的转化彻底。（99.2） 底物浓度较低时，反应速度始终较慢底物浓度较低时，反应速度始终较慢 对底物富马酸盐的转化不彻底。（对底

25、物富马酸盐的转化不彻底。（63）特点：特点： 高质量底物浓度有较高的反应速率高质量底物浓度有较高的反应速率 高质量浓度底物有较高的转化率高质量浓度底物有较高的转化率 催化反应一般有个迟滞期催化反应一般有个迟滞期酶细胞在生物转化中的形态变化酶细胞在生物转化中的形态变化低底物浓度扫描观察低底物浓度扫描观察酶细胞在生物转化中的形态变化酶细胞在生物转化中的形态变化高底物浓度扫描观察高底物浓度扫描观察形态学变化形态学变化 高质量底物浓度下细胞发生明显的形态学高质量底物浓度下细胞发生明显的形态学变化变化 细胞表面发上皱褶，有明显的凹陷细胞表面发上皱褶，有明显的凹陷 细胞膜变薄，松弛、不明显，内部结构细胞膜

26、变薄，松弛、不明显，内部结构变松，不致密。变松，不致密。高质量浓度底物对含酶细胞的渗透化作用高质量浓度底物对含酶细胞的渗透化作用静息细胞法静息细胞法 为了排除原培养基中自身的代谢产物对不同生长为了排除原培养基中自身的代谢产物对不同生长阶段转化的影响，常常用洗涤的静息细胞来代替阶段转化的影响，常常用洗涤的静息细胞来代替发酵液中的生长的细胞，即将不同生长阶段的细发酵液中的生长的细胞，即将不同生长阶段的细胞取出，洗去沾染的原培养液及其代谢产物，然胞取出，洗去沾染的原培养液及其代谢产物，然后把细胞悬浮在人工转化系统内，在一定条件后把细胞悬浮在人工转化系统内，在一定条件 下下进行生物转化。进行生物转化。

27、孢子转化法孢子转化法 真菌的分生孢子和子囊孢子，往往含有的酶真菌的分生孢子和子囊孢子，往往含有的酶活力高，且常常用于生物转化。活力高，且常常用于生物转化。 细菌的内生孢子（芽孢），一般无转化活性。细菌的内生孢子（芽孢），一般无转化活性。转化方法转化方法相似于静息细胞法。相似于静息细胞法。 不采用完全培养基，只选用缓冲液或含有不采用完全培养基，只选用缓冲液或含有葡萄糖一类能源的物质即可。葡萄糖一类能源的物质即可。 通常转化时使用的孢子浓度为通常转化时使用的孢子浓度为108109个个/ml. 转化转化pH一般为一般为5-6原生质体试验法原生质体试验法方法方法 通过溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等脱去通过

28、溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等脱去细胞壁，获得原生质体。细胞壁，获得原生质体。 将原生质体悬浮于高渗稳定液中，添加前将原生质体悬浮于高渗稳定液中，添加前体物质，进行喂养试验，观察结果。体物质，进行喂养试验，观察结果。原生质体试验法特点原生质体试验法特点排除了细胞壁通透性障碍。排除了细胞壁通透性障碍。保全了整体细胞的内酶系统。保全了整体细胞的内酶系统。避免了无细胞抽提法中，用破碎细胞而损坏避免了无细胞抽提法中，用破碎细胞而损坏了酶体系，从而使某些需要偶联的酶反应了酶体系，从而使某些需要偶联的酶反应（氧化还原反应）不能进行的缺点。（氧化还原反应）不能进行的缺点。遗传特性诱变法遗传特性诱变法菌种诱变不仅是提高产量的重要手段，而且也是研菌种诱变不仅是提高产量的重要手段，而且也是研究生物转化过程中，产物形成的遗传机制的一种究生物转化过程中，产物形成的遗传机制的一种有效方法。有效方法。将转化菌进行诱变，使其失去转化底物或形成某个将转化菌进行诱变，使其失去转化底物或形成某个中间体的能力，从而就可