Bax基因诱导鼻咽癌细胞中相关基因

1、Bax基因诱导鼻咽癌细胞中相关基因的mRNA差异显示分析中国生物工程杂志China Biotechnology, 2006, 26(2):6973董加喜1*李运南1陈郧东1马涧泉2( 1广州市微生物研究所广州5102502 中山大学基础学院广州51000 )摘要目的：应用差异显示技术，筛选鼻咽癌相关基因的异常表达。方法：选用连接有bax基因的真核表达质粒pSFFVbaxneo, 采用脂质体转染法, 将其转染到CNE2细胞中, 以转染有空载的pSFFV neo 质粒的CNE2细胞为对照, 采用Trizol试剂快速抽取法, 提取mRNA经逆转录成cDNA,用锚式引物和随机引物进行PCR扩增, 加入

2、同位素, 用6%的测序变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳PCR产物进行分离。切下聚丙烯酰胺凝胶上明显的6条差异带, 回收差异cDNA, 进行第二次PCR扩增, 经低溶点琼脂凝胶回收, 获取大量PCR扩增的差异cDNA片段，同位素标记作为探针, 抽取RNA, 进行点样, 杂交, 洗膜放射自显影等步骤, 进行细胞RNA的Northern印迹斑点杂交。结果：表明4条cDNA片段均为CNE2细胞表达片段。结论：发现bax可诱导CNE2细胞中有某些相关基因表达，并抑制了CNE2细胞某些相关基因表达。关键词bax基因鼻咽癌细胞差异显示技术中图分类号Q819收稿日期：20050825修回日期：20051209* 电子

3、信箱：Sddongjx本文采用mRNA差异显示技术去观察bax基因对CNE2细胞的诱导表达而产生的差异情况, 并检测出bax基因诱导鼻咽癌CNE2细胞表达的差异相关基因, 从而探讨bax基因诱导细胞凋亡的可能机制1，为进一步研究这些基因的功能作准备。1材料和方法1.1材料baxneo、pSFFV neo和宿主菌JM109：均由中山大学基础学院生物化学教研室张清秀博士提供。p32dATP：购于北京亚辉生物公司。1.2方法。形成2天1代，用0.25%胰酶消化, 吹打分散细胞, 将1瓶分作3瓶, 待细胞长至七成满, 用于转染。baxneo、pSFFV neo转染入鼻咽癌CNE2细胞株, 采用常规的脂

4、质体转染法。baxneo、pSFFV neo质粒转染CNE2细胞总RNA的抽取：按 Trizol试剂使用说明书提供的方法进行。lDEPC处理蒸馏水溶解RNA, 测A260进行RNA定量，-20保存, 取5l电泳观察结果。g/l) 2.0l, 锚式引物(AP)2.0l, 混匀, 70, 5min, 冰上冷却 5min, 各管再按下述操作, 5×buffer 4.0l, dNTA(250mol/L) 2.0l, DTT(100mol/L) 2.0l, MMLV(200mol/L) 2.0l, H2O 7.8l, 各管总体积20l, 混匀, 加消毒石蜡油30l, 37或42水浴1h, 转入

5、70,15min, 4保存。2006, 26(2)董加喜 等： Bax基因诱导鼻咽癌细胞中相关基因的mRNA差异显示分析中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.26 No.2 2006×buffer 1.0l, MgCl2(50mmol/L) 0.75l, dNTA(250mol/L)2.0l, 5ARP(2mol/L) 1.75l, 3AP(2mol/L)1.75l, ap23dATP 0.55l, 反转录产物2.0l，Taq酶(5U/l) 0.2l, 振荡混匀各管, 离心, 各加30l石蜡油，置PCR仪中反应。×TBS 12ml, 置45水浴搅

6、拌10min, 使尿素全部溶解, 定容为60ml, 加TEMED 35ml, 新配制10%过硫酸铵250l, 混匀, 灌胶, 凝聚3h后, 在1200V 电压下预电泳30min。上样。上样操作程序为：吸取上述PCR 样品5l, 加上样缓冲液1l, 沸水浴10min, 冰浴5min, 离心。电泳条件为：室温下, 电压1200V, 电泳3h，关闭电泳。将凝胶转移至3m滤纸上, 用保鲜膜包被凝胶, 放入干燥机上, 80, 抽直空干燥1h,标记定位后, 将凝胶和X光片一册同时放入胶片盒，-20曝光120h，用冲片机冲洗X光片, 比较不同组别表达差异带。l蒸馏水的离心管中, 浸泡10min。盖上离心管盖

7、, 100水浴15min。4, 5000r/min, 离心5min, 上清液转移至新的1.5ml离心管。加入10l 3mol/L醋酸钠, 5l糖原(10g/ml)及450l无水乙醇, 置-80过夜。4,20000r/min, 离心30min, 去上清, 沉淀用85%乙醇漂洗, 室温干燥去乙醇。用15l蒸馏水溶解DNA，-20贮存。2次PCR：取0.5ml离心管6支, 每管按下述操作， 10×buffer 4.0l, MgCl2 (50mmol/L) 1.2l, dNTP(250m mol/L)3.2l, 锚试引物(AP.2mol/L) 4.0l, 随机引物(ARP.2mol/L) 4

8、.0l, 上述回收差异带cDNA液 6.0l, Taq酶(5.0U/l) 0.4l, H2O 17.2l, 反应总体积为 40l, 振荡混匀各管, 离心, 各加50l消毒石蜡油,置PCR仪中反应。PCR循环条件同前。baxneo所诱导表达或其抑制表达的相关基因, 本文分别利用己分离获得的差异cDNA作为探针, 对细胞RNA进行了Northern印迹斑点杂交, 方法是, 细胞RNA的抽取同前。随机引物法标记差异cDNA探针：模板DNA 2l(25mg), 随机引物(690) mer (1mmol/L) 2l, H2O 10l, 95加热3min, 立即水上冷却, 5min, 10×Ke

9、now buffer 2.5l, dNTP(0.2mmol/L dATP、dGTP、dTTP)2.5l, 111TBq/mmolap23dCTP 5l, Kenow酶 1l, Total 25l, 37水浴, 3h, 65水浴, 5min。将各反应管分别过G50层析柱, 收集流出组分。点样：将尼龙膜浸泡在20×SSC浴液中30min, 再用10×SSC装满加样孔, 抽干重新装满抽干。待测细胞RNA加入2倍体积20×SSC , 抽干样孔, 加样后抽干, 用10×SSC装满抽干2次, 继续抽干5min, 80干烤1h，备用。杂交：将上述尼龙膜标记后, 放入预

10、杂交液中42 20min, 用液量为0.1ml/cm2膜。杂交：分别将32P 标记的各探针液加入预杂交液中, 混匀, 42 0.52h,加入探针量为05pmol/ml。洗膜：用100ml 2×SSPE, 0.1%SDS 在室温下洗膜2次,5min/次。用洗膜液I、洗膜液II、在室温下洗膜2次，20min/次。显影：压片、冲片。2结果2.1pSFFVbaxneo和pSFFVneo细胞株（图1、2、3）图1 G418筛选第3天大量CNE2细胞死亡×200Fig.1Most dead CNE2 cells screened by G418 three days later图2G4

11、18筛选第7天有成活的独立细胞×200Fig.2Survival cells screened by G418 seven days later图3G418筛选第10天形成的CNE2细胞克隆×200Fig.3Formed CNE2 cell clones screened by G418 ten days later上述抽取的总RNA, 经过RTPCR后, 进行多次差异显示技术, 并在同一条件下重复实验, 从DNA聚丙烯凝胶电泳的放射自显影的X光片可发现2株CNE2有差异基因表达, 最终发现有10条明显的基因表达水平存在差异,其中由pSFFVbaxneo诱导CNE2细胞基因

12、表达的差异带有4条, 在pSFFVbaxneo的CNE2细胞中不被表达的差异带有6条。具体表现在由锚链引物AP3和随机引物ARP3组合进行PCR扩增, 产生在pSFFVbaxneo的CNE2细胞中有2条明显基因表达的差异带, 而在pSFFVneo的CNE2细胞中表达, 在pSFFVbaxneo的CNE2细胞中不表达的差异带有3条（图4）。锚链引物AP1和随机引物ARP3组合进行PCR扩增, 在胶片上出现pSFFVbaxneo的CNE2细胞有2条明显基因表达的差异带（图5）。锚链引物AP2和随机引物ARP4组合进行PCR扩增。在胶片上出现pSFFVbaxneo的CNE2细胞不表达, 而在pSFF

13、Vneo的CNE2细胞中表达3条差异带（图6）。图4AP3、ARP3组合扩增的电泳差异图A泳道：转染有pSFFVbaxneo的CNE2差异图;B泳道：转染有pSFFV neo的CNE2差异图; ：差异带Fig.4Combined amplification of AP3 and APR3图5AP1、ARP3组合扩增的电泳差异图A泳道：转染有pSFFVbaxneo的CNE2差异图; B泳道：转染有pSFFV neo的CNE2差异图; ：差异带Fig.5Combined amplification of AP1 and APR3图6AP2、ARP4组合扩增的电泳差异图A泳道：转染有pSFFVbax

14、neo的CNE2差异图；B泳道：转染有pSFFV neo的CNE2差异图； ：差异带Fig.6Conbined amplification of AP2 and APR42.2二次PCR在将10个有差异显示的带从凝胶上选择切下6条最明显的条带, 进行PCR, 发现有4个条带能扩增出PCR产物, 另有2条则没有PCR条带出现。2.3Northern 印迹斑点杂交将抽取pSFFVbaxneo的CNE2细胞和pSFFV neo的CNE2细胞中的RNA与低熔点琼脂糖凝胶回收的差示cDNA, 经32P同位素标记成探针, 分别与对应细胞的RNA进行杂交。在放射自显影的X片上有印迹斑点出现, 本实验所得到的

15、cDNA均为CNE2细胞表达的cDNA片段（图7）。图7差示cDNA Northern 印迹斑点杂交图Fig.7cDNA Northern blot of differentially expressed genes3讨论凋亡bax基因是Oltvai1在1993年发现的一种bcl2相关基因; 长为4.5kb, 含有6个外显子, 编码3种蛋白质1。在体内有较广泛的分布, 说明bax可能是比较重要的凋亡调节基因2 。研究发现bax的分布与细胞的分化有关, 如与正常大肠粘膜表层上皮细胞的正常脱落及隐窝底部上皮的增生一致2，还发现鼻咽良性上皮多数有bax表达, 上皮表层细胞基质层表达增强, bax表达

16、与肿瘤发生有关, Bargou等3观察到正常乳腺细胞系和乳腺组织中bax出现高表达, 而在癌细胞系和恶性乳腺细胞中bax表达降低或消失，郭琳琅等4研究发现鼻咽良性上皮有较高bax表达, 鼻咽癌组织中bax表达减少, 且组织分化程度越低, bax表达减少,显示bax异常表达可能与鼻咽上皮癌变有关。因而本文是将bax连接在pSFFVneo真核表达质粒中5，转人鼻咽癌CNE2细胞中去探讨bax对CNE2的影响。结果发现bax可诱导CNE2细胞中有某些相关基因的表达, 还抑制了CNE2细胞某些相关基因表达。随着有关肿瘤发生机制的研究有了较深入的发展, 癌基因和抑癌基因理论的提出6,7，使人们认识到肿瘤

17、的发生是基因表达失调的结果, 因而探索肿瘤发生的分子生物学基础, 寻找出肿瘤细胞与正常细胞或肿瘤细胞不同影响因素中不同表达的基因, 发现新的癌基因和抑癌基因, 已成为当今肿瘤研究的一个方向8 ；1992年Liang及Pardee等首创了信使RNA差异显示技术, 为肿瘤分子生物学研究提供了良好的途径。mRNA差异显示技术(DDPCR)基本原理9是将基因背景相同的2个或几个细胞系或组织mRNA逆转录成cDNA, 用不同引物对, 进行PCR扩增, 扩增时加入同位素, 用测序胶电泳将PCR产物进行分离, 在放射自显影上即可找出差异表达基因的被扩增片段。DDPCR在理论上十分简捷明了, 但在实际应用中却

18、存在着许多的问题1，其中最主要是：DDPCR中, PCR产物极多, 几乎所有模板的启动均有引物的错配; DDPCR技术会产生假阳性条带。本研究为了克服这些问题, 选用了贝克曼公司的DDPCR引物体系1012，因本引物体系经改进设计, 很好地解决了上述问题, 明显增加了DDPCR的可靠性, 使我们利用DDPCR筛选鼻咽癌CNE2细胞差异表达基因的效率大大提高。具体表现在如下几个方面：其一, 3锚链引物，长度为31个碱基, 每个锚链引物使用2个非dT碱基来促进引物配对和合成不同的mRNA亚群的cDNA第一链。这将显著地降低cDNA的数量, 明显提高了每道DDPCR胶中片段的分辨率; 并减少了错配率

19、。而且由于DDPCR中参与竞争引物和其他试剂的片段数量减少, 两核苷酸锚链设计可将稀少的mRNA种类转变成cDNA片段而显现在DDPCR胶上。又因锚链引物还含有部分T7RNA聚合酶启动子, 因此每一个cDNA片段切割回收, 再扩增后可直接合成放射性标记的反义RNA或者直接测序而无需将片段克隆在质粒载体上。其二, 5随机引物, 长度为26碱基, 明显长于过去DDPCR所用的引物长度, 因而这种随机引物配对位点的选择缺乏绝对的严格性, 使得每种cDNA的第一链合成不止一个引物配对位点, 这就保证了每种mRNA至少有一个对应的双链cDNA片段, 并通过电泳而在DDPCR胶上显示出来; 这些随机引物的

20、灵活性为其提供了相互重叠的机会, 从而避免了随机引物配对区域覆盖的空白区。cDNA片段从DDPCR胶上切下后, 可用M13(48)的24mer反向引物再扩增。这样就能对原转录子编码链从5端单向测序。其三：引物长度，锚引物和随机引物明显长于以前DDPCR所用引物，这可提高DDPCR退火温度, 从而避免错误引物配对产生假阳性。本实验结果显示在4条锚引物和4条随机引物配对进行扩增的电泳结果, 在胶上只呈现10条明显差异带, 其中扩增出的4条差异带经Northern印迹斑点杂交, 均有印迹斑点, 说明本研究己克服了DDPCR中PCR产物多和假阳性条带的缺点。参考文献1 Oltvai Z N, Mill

21、iman C L, Korsmeyer S T,et al. Bcl2 heterolimerizes in vivo with a conserved homologous bax, that accelerater programmed cell death. Cell, 1993, 74:6096192 Krejewski S, Krejewska M, Shabaik A, et al. Immunohistochemical determination of in vivo distribution of Bax, a dominant inhibitor of Bcl2. Am J

22、 Pathol, 1994,145(6):132313363Bargou R C, Daniel P T, Mapara M T, et al. Expression of the bcl2 gene family in normal and malignant breast tissue:low baxalpha expression in tumor cells correlates with resistance towards apoptosis. Int J Cancer,1995,60(6):8548594 郭琳琅，黄金中，曹长安凋亡蛋白bax在鼻咽癌中的表达及与EB病毒感染的关系

23、中国耳鼻咽喉颅底外科杂志，1997,4：197Guo L L, Huang J ZH, Cao CH A. Study of expression of bax protein and its relation with EB virus in nasopharyngeal carcinoma. Chinese Journal of Otorhinolaryngologyskull Base Surgery, 1997,4:1975 Harnois D M, Que F G, Celli A, et al. Bcl2 is overexpressed and alters the thresh

24、old for apoptosis in a cholangiocarcinoma cell line. Hepatology,1997,26:8858906 Sager R. Tumor suppressor genes: the puzzle and the promise. Science, 1989,246(4936):140614127 Aronson S A. Growth factors and cancer. Science, 1991,254(5035):114611538 王莉，陆玮mRNA差异显示技术与肿瘤分子生物学研究国外医学（肿瘤学分册），1996,23（2）：848

25、6Wang L, Lu W. Foreign Medical Sciences, 1996,23(2):84869 张权庚，张友会mRNA差异显示法在分离肿瘤转移相关基因中的初步应用中国医学科学院学报，1997,19（5）：384Zhang Q G, Zhang Y H. Acta Academiae Medicinae Sinicae, 1997,19(5):38410 Bertioli D J. An analysis of differential display shows a strong bias towards high copy number mRNAs. Nucleic Ac

26、ids Res, 1995,23(21):4520452311 Linskens M H. Cataloging altered gene expression in yound and senescent cells using enhanced differential display. Nucleic Acids Res, 1995,23(16):3244325112 Zhao S. Biotechniques,1995,18(5):842846,848,850In CNE2 Cell After Bax Gene Transfection Analysed by mRNADeffere

27、nce to DemonstrateDONG Jiaxi1LI Yunnan1CHEN Yundong1MA Jianquan2(1 Guangzhou Microbiology Research InstituteGuangzhou510250, China)(2 Medcollege of Sun YatSen UniversityGuangzhou510000, China)AbstractObjective ：To look for the correlated gene of CNE2 cell after bax gene transfection. Method: In CNE2 cell after bax gene transfection analysed by mRNA defference to demonstrat