培养基及配制

1、培养基培养基种类种类成分成分配制配制技术技术一、培养基一、培养基 培养基的成分培养基的成分3 碳源和能源碳源和能源 4 植物激素植物激素 1 无机盐无机盐 2 有机物有机物 5 琼脂琼脂 6 辅助物质辅助物质1 1 无无 机机 盐盐 元素名称元素名称 添加形式添加形式 N KNO3, NH4NO3大量大量 P KH2PO4 NaH2PO4元素元素 K KCl KNO3 (0.5mmol/L) Ca CaCl2 2H2O Mg Mg2SO4 7H2O S Fe FeNa2-EDTA微量微量 B H3BO3元素元素 Mn MnSO4( 0.5mmol/L) Cu CuSO4 Mo Na2MoO4

2、2H2O Cl CaCl2 2H2O1）大量元素）大量元素N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。要的位置。 P是磷脂的主要成分。培养基中常用是磷脂的主要成分。培养基中常用KH2PO4 NaH2PO4等。等。 K对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。密切关系。Mg、S、Ca是叶绿素的组成成分，又是激酶的是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；S

3、是含是含S氨基酸的蛋白质的组成成分。氨基酸的蛋白质的组成成分。Ca是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，膜结构有显著作用，此外，Ca及钙调素在细胞及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。信号转导中起重要作用。2）微量元素）微量元素 在微量元素中，在微量元素中，铁铁的使用最大，铁的使用最大，铁是一些氧化酶的组成成分。同时又是叶是一些氧化酶的组成成分。同时又是叶绿素形成的必要条件。绿素形成的必要条件。 由于培养基的由于培养基的pH较高，所以培养中较高，所以培养中几乎都使用不易分解的乙二胺四乙酸铁几乎都使用不易分解的乙二胺四乙酸铁这种鳌合物来

4、防止铁的沉淀。这种鳌合物来防止铁的沉淀。 硼硼与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系；系； 铜铜是某些氧化酶的成分，能够促进离体根是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长；的生长； 锰锰参与植物的光合、呼吸代谢；参与植物的光合、呼吸代谢； 钼钼参与氮素的代谢；参与氮素的代谢； 氯氯是光合作用水光解的活化剂。是光合作用水光解的活化剂。 微量元素的主要作用是作为酶的辅助微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节。因子或激活剂参与代谢的调节。No MS salts没有任何生长特征没有任何生长特征MS salts 0.47 g. l-1 长出更多的根长出

5、更多的根MS salts 9.52 g. l-1 长大量的再生苗而长大量的再生苗而无根无根 2有有机机物物2.1维生素维生素2.2 肌肌 醇醇2.4 氨基酸氨基酸2.3天然复合物天然复合物种类：种类： 硫胺素硫胺素-维生素维生素B1 VB1 吡哆素吡哆素-维生素维生素B6 VB6 烟烟 酸酸-维生素维生素B3 Vpp 抗坏血酸抗坏血酸-维生素维生素C Vc 以及以及B5、生物素、叶酸。、生物素、叶酸。浓度：浓度：0.11.0mg/L作用：作用： VB1促愈伤组织产生，提高活力促愈伤组织产生，提高活力VB6 促根生长促根生长Vpp与代谢和胚发育有关与代谢和胚发育有关Vc 防组织褐变防组织褐变2.

6、1 维生素维生素2.2 肌醇肌醇 促进愈伤组织生长、促进愈伤组织生长、胚状体和芽的形成胚状体和芽的形成 对组织细胞繁殖、对组织细胞繁殖、分化的促进作用分化的促进作用 浓度浓度100 mg/L100 mg/L 2有有机机物物2.1维生素维生素2.2 肌肌 醇醇2.4 氨基酸氨基酸2.3天然复合物天然复合物椰乳：椰乳：促愈伤组织和细胞培养，促愈伤组织和细胞培养，用量用量1020%。使用注。使用注意茎尖大小。意茎尖大小。 2.3 天然复合物天然复合物香蕉泥：香蕉泥：对对pH值缓冲大，用量值缓冲大，用量150 200ml/L ， 应用应用在兰花组培。在兰花组培。 水解酪水解酪(乳乳)蛋白：蛋白：浓度浓

7、度100-200mg/L，多用于微茎尖培养。多用于微茎尖培养。天然复合物天然复合物马铃薯提取液：马铃薯提取液：对对pH值缓冲大，用量值缓冲大，用量150-200g/L，使苗壮。，使苗壮。其它：其它：NoImage2.4 氨基酸氨基酸 p 种类：甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、丝氨酸、丙种类：甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸以及酰胺类物质（如天门冬酰胺）氨酸、半胱氨酸以及酰胺类物质（如天门冬酰胺）和多种氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋和多种氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白）等。白）等。p 注意：氨基酸类物质只有在含有无机氮的情况注意：氨基酸类物质只有在含有无机氮的情况下，对

8、离体组织生长才有较好的效果。下，对离体组织生长才有较好的效果。 培养基的成分培养基的成分 第一节第一节3 碳源和能源碳源和能源 4 植物激素植物激素 1 无机盐无机盐 2 有机物有机物 5 琼脂琼脂 6 辅助物质辅助物质3 碳源和能源碳源和能源种类：种类：蔗糖或葡萄糖、果糖、砂糖等。蔗糖或葡萄糖、果糖、砂糖等。蔗糖浓度：蔗糖浓度：1-5%，胚培养为，胚培养为4-15%。注意：注意：高压灭菌部分糖会分解。高压灭菌部分糖会分解。大生产时可用白砂糖。大生产时可用白砂糖。作用：作用：作为离体组织赖以生长的碳源作为离体组织赖以生长的碳源使培养基维持一定的渗透压（一般在使培养基维持一定的渗透压（一般在1.

9、5-4.1MPa）蔗糖蔗糖 （0%）蔗糖含量（蔗糖含量（ 1%）蔗糖含量蔗糖含量（ 5%）在外植体上既没有在外植体上既没有芽发生，也没有根芽发生，也没有根和愈伤组织产生和愈伤组织产生在外植体上表面边缘在外植体上表面边缘产生芽，也有一些根产生芽，也有一些根发生发生芽从外植体的上表面发芽从外植体的上表面发生而根从下表面发生生而根从下表面发生4 植物激素植物激素4.1.生长素类生长素类（1）种类）种类 IBA吲哚丁酸；吲哚丁酸； IAA吲哚乙酸；吲哚乙酸； NAA萘乙酸；萘乙酸； 2,4-D-2,4-二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸 使用效价：使用效价： IAAIBANAA2,4-D NAA、IBA 生根培

10、养生根培养 2,4-D 愈伤组织诱导与增殖愈伤组织诱导与增殖（2）作用）作用诱导愈伤组织和根分化，促进细胞分裂诱导愈伤组织和根分化，促进细胞分裂和伸长。和伸长。 NAA和和IBA常与细胞分裂素结合用于芽的增殖。常与细胞分裂素结合用于芽的增殖。（3）浓度）浓度0.055mg/L（4）配制配制 生长素可溶解在稀生长素可溶解在稀NaOH中或溶于乙醇。中或溶于乙醇。4.2 细胞分裂素（细胞分裂素（CTK）（1）种类：）种类：Kt-激动素激动素 BAP-苄氨基嘌呤苄氨基嘌呤 2iP-异戊烯腺嘌呤异戊烯腺嘌呤 ZT-玉米素玉米素 TDZ（2）作用：）作用：启动脱分化、细胞增殖，诱导愈伤组织芽启动脱分化、细

11、胞增殖，诱导愈伤组织芽分化、芽增殖，丛生芽。分化、芽增殖，丛生芽。（3）浓度：）浓度：0.0510.0mg/L （4）配制：配制：溶于稀酸或稀碱溶于稀酸或稀碱 激素配比模式激素配比模式生长素与细胞分裂素：生长素与细胞分裂素：它们的比例决定着发育的方向，是愈它们的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。伤组织、长根还是长芽。 高：有利于根的形成和愈伤组织的形成；高：有利于根的形成和愈伤组织的形成； 适中：有利于根芽的分化；适中：有利于根芽的分化； 低：有利于芽的形成低：有利于芽的形成生长素生长素 细胞分裂素细胞分裂素= 如：为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素如：为了促进芽器官的分化

12、，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。例。细胞细胞分裂分裂素与素与生长生长素对素对器官器官或愈或愈伤组伤组织的织的影响影响No BAPBAP 0.1 mg. l-1 No NAAPoor shoot development and no roots. Extensive callus generationPoor shoot development and no rootsNAA 0.1 mg. l-1 More balanced development of roots and shoots. However, u

13、ndifferentiated callus is developing at the edges of the explantProfuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explantNAA 5.0 mg. l-1Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some cal

14、lus4.3 4.3 赤霉素（赤霉素（GAsGAs）（1 1）种类：）种类：GA3（2 2）作用：）作用：促茎伸长，促胚发育成植株；打促茎伸长，促胚发育成植株；打破休眠；一般在器官形成后加入。破休眠；一般在器官形成后加入。 注意：不耐热；不耐热；生理活性生理活性515d，时间太长，时间太长有抑制作用。有抑制作用。 较生长素和细胞分裂素少用，可溶于水。较生长素和细胞分裂素少用，可溶于水。5 琼脂琼脂/培养体支持材料培养体支持材料5.1.琼脂琼脂(1)用量用量 610g/L(2)种类种类 琼脂粉琼脂粉 琼脂条琼脂条(3)作用作用 固化作用固化作用注意：注意：琼脂使用有优缺点；新买应试凝固力。琼脂使

15、用有优缺点；新买应试凝固力。不凝原因：不凝原因：pH5不凝；长时间高压灭菌；不凝；长时间高压灭菌； 长期存放，易变质；厂家不同，杂质含量不同长期存放，易变质；厂家不同，杂质含量不同 配制时融解不充分，分装不均匀；配制时融解不充分，分装不均匀；5.2.5.2.其它其它玻璃纤维滤纸桥海绵、卡拉胶等玻璃纤维滤纸桥海绵、卡拉胶等6辅辅助助性性物物质质6.3 抗生素抗生素6.2 抗氧化物抗氧化物6.1 活性炭活性炭6.1 活性炭活性炭1)作用：作用：具吸附作用；具吸附作用； 茎尖初代培养可防褐化；促进新梢增殖（浓度茎尖初代培养可防褐化；促进新梢增殖（浓度0.1 -0.2%）；）； 促进生根促进生根,根避

16、光生长；根避光生长； 防止组培苗玻璃化（浓度防止组培苗玻璃化（浓度0.3%）；）； 有利于胚胎培养。有利于胚胎培养。2)常用浓度：常用浓度：0.510g/L3)注意：注意：活性炭具副作用。选择活性炭具副作用。选择吸附性差，导致营养损耗和吸附性差，导致营养损耗和 pH，应适当调高营养物质与激素水平，应适当调高营养物质与激素水平，并加大并加大Agar用量。用量。6.2 抗生素抗生素用量：用量：用量520mg/L注意：注意：抗生素对组织生长有抑制作用，使抗生素对组织生长有抑制作用，使用要慎重。用要慎重。 多数需过滤灭菌多数需过滤灭菌。作用：抑制内生菌；种类：青霉素、链霉素、庆大霉素、庆大霉素、利福平

17、、卡那霉素等，6.3 抗氧化物抗氧化物2)用量：用量：50200mg/L，3)作用：作用：防止氧化防止氧化4)注意：注意：可用抗氧化剂洗可用抗氧化剂洗涤外植体伤口表面。涤外植体伤口表面。1)常用抗氧化剂：常用抗氧化剂：半胱氨酸、半胱氨酸、VC6.4 其它成分：其它成分：AgNO3 ： 作用：作用：吸附乙烯，促进茎芽分化，防玻璃吸附乙烯，促进茎芽分化，防玻璃化苗、早衰、落叶；只能短期培养，化苗、早衰、落叶；只能短期培养， 用量用量 110mg/L，需过滤灭菌需过滤灭菌pH值 在灭菌之前培养基的在灭菌之前培养基的pH值一般都是调节到值一般都是调节到5.0-6.0。 一般来说，当一般来说，当pH值高

18、于值高于6.0时培养基将会变硬；时培养基将会变硬； 低于低于5.0时，琼脂不能很好地凝固。时，琼脂不能很好地凝固。 pH值对不同植物的影响会有差异，如玉米胚乳愈值对不同植物的影响会有差异，如玉米胚乳愈伤组织在伤组织在pH值值7.0时鲜重增加最快，在时鲜重增加最快，在pH值值6.1时时干重增长最快。干重增长最快。种类种类最适最适pH值值种类种类最适最适pH值值杜鹃杜鹃4.0月季月季5.8越桔越桔4.5胡萝卜、石刁柏胡萝卜、石刁柏6.0蚕豆蚕豆5.5桃桃7.0番茄番茄5.7 不同植物对培养基最适不同植物对培养基最适pH值的要求不同值的要求不同(见表见表)二、 培养基的制备 1 水和药品 水是植物原

19、生质体的组成成分，也是一切代谢过水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。的物质。 配制培养基母液时要用配制培养基母液时要用蒸馏水或重蒸馏水蒸馏水或重蒸馏水，以保，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。霉变质。 大规模生产时可用自来水。大规模生产时可用自来水。 但研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不但研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。良效果。药品：药品： 应选取等级较高的化学纯（应选取等级较高的化学纯（CP）或分析纯）或分析纯(

20、AR)； 药品的称量一定要准确、正确，防止药勺药品的称量一定要准确、正确，防止药勺之间的交叉污染。之间的交叉污染。2.1 母液（贮备液，母液（贮备液，stock solution)配制的目的配制的目的1）方便配置其他培养基；）方便配置其他培养基；2）保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取）保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取3）便于低温保藏。便于低温保藏。 2.2 母液配制方法母液配制方法（1）单配法：）单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。定浓度的母液。（2）混配法：）混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一将几类营养成分按配方中的

21、用量扩大一定倍数称量，分别溶解后每一类混合在一起定容到一定倍数称量，分别溶解后每一类混合在一起定容到一定体积配成混合母液定体积配成混合母液.（3）一般原则：）一般原则：p一般母液配成比所需浓度高一般母液配成比所需浓度高10-1000倍。倍。p母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。其中维生素、氨基酸类可以分别有机物和激素类等。其中维生素、氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起配制，也可以混在一起p配制时注意一些离子之间易发生沉淀，如配制时注意一些离子之间易发生沉淀，如Ca2+和和SO42-，Ca2+、Mg2+和和PO43- 一

22、起溶解后，会产生沉淀，一定一起溶解后，会产生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。要充分溶解再放入母液中。p各种药品先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。各种药品先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。p母液配好后放冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。母液配好后放冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。（4）母液配制的药品与器材（5）母液配制（以）母液配制（以MS培养基为例）培养基为例） 有机物母液有机物母液铁盐母液铁盐母液无机大量无机大量 母液母液无机微量母液无机微量母液激素母液激素母液配制MS培养基时母液的计算B 无机微量母液（扩大100倍配1000ml）铁盐铁盐硫酸亚铁，硫酸亚铁，Na2-EDTA 在

23、装有在装有800ml 蒸馏水的烧杯中加入蒸馏水的烧杯中加入2粒氢氧化钠。溶解后粒氢氧化钠。溶解后加入加入3.73g EDTA-Na2，加热使其全部溶解，然后边搅拌边慢加热使其全部溶解，然后边搅拌边慢慢加入慢加入2.78g FeSO4.7H2O直至全部溶解，冷却后定容至直至全部溶解，冷却后定容至1000ml，置于冰箱中备用。置于冰箱中备用。有机物有机物甘氨酸甘氨酸VB1VB6烟酸烟酸肌醇肌醇后，再加后，再加入温水冷却后定容。入温水冷却后定容。(6) 母液的保存1) 装瓶装瓶: 将配制好的母液将配制好的母液分别倒入瓶中，贴好标分别倒入瓶中，贴好标签，在标签上注明母液签，在标签上注明母液名称，配制倍

24、数，与配名称，配制倍数，与配制日期。制日期。2）储藏）储藏： 母液配好后放人母液配好后放人冰箱内冰箱内4低温保存，用低温保存，用时再按比例稀释。时再按比例稀释。母液的稀释计算吸取量吸取量=需要配制培养基的体积需要配制培养基的体积X 需要配制浓度需要配制浓度 母液浓度母液浓度其他准备其他准备加琼脂加琼脂第三节第三节 常用培养基的配方及其特点常用培养基的配方及其特点1 培养基的种类培养基的种类1.1 根据其态相不同分为根据其态相不同分为固体培养基：固体培养基：是指加凝固剂（如琼脂）的培养基。是指加凝固剂（如琼脂）的培养基。液体培养基：液体培养基：是指不加凝固剂的培养基。是指不加凝固剂的培养基。 1

25、.2 根据培养物的培养过程分为根据培养物的培养过程分为初代培养基：初代培养基：是指用来第一次接种从植物体上分离是指用来第一次接种从植物体上分离下来的外植体的培养基。下来的外植体的培养基。继代培养基：继代培养基：是指用来接种继初代培养之后的培养是指用来接种继初代培养之后的培养物的培养基。物的培养基。1.3 根据其作用不同分为根据其作用不同分为诱导培养基、增殖培养基、生根培养基诱导培养基、增殖培养基、生根培养基1.4 根据其营养水平不同分为根据其营养水平不同分为基本培养基：基本培养基：主要有主要有MS、White、B5、N6、改良、改良MS、Heller、Nitsh、Miller、SH等等完全培养

26、基：完全培养基：就是在基本培养基的基础上，根据试就是在基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如植物生长调节验的不同需要，附加一些物质，如植物生长调节物质和其它复杂有机附加物等。物质和其它复杂有机附加物等。下面介绍几种基本培养基下面介绍几种基本培养基:基本培养基基本培养基无机盐、离子无机盐、离子 浓度高，浓度高，含高含高K、N，硝酸盐含量较，硝酸盐含量较高，含铵盐高，含铵盐。营养丰富营养丰富加速合作愈伤组织和培加速合作愈伤组织和培养物生长养物生长1962年由年由Murashige和和Skoog为培养烟为培养烟草细胞而设计的。广泛地用于植物的草细胞而设计的。广泛地用于植物的器官、花

27、药、细胞和原生质体培养，器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而效果良好。有些培养基是由它演变而来的来的。MSMS培养基培养基MillerMiller培养基培养基B5培养基培养基SHSH培养基培养基N6培养基培养基KM-8P培养基培养基White培养基培养基基本培养基基本培养基无机元素用量是无机元素用量是MS的的1/31/2微量种类少微量种类少无肌醇无肌醇MSMS培养基培养基MillerMiller培养基培养基B5培养基培养基SHSH培养基培养基N6培养基培养基KM-8P培养基培养基White培养基培养基基本培养基基本培养基无机盐量较低无机盐量较低使用广泛使用广泛适合生

28、根培养、胚适合生根培养、胚 胎培养等胎培养等提高了提高了MgSO4的浓度和增加了的浓度和增加了硼素。其特点是无机机盐数量硼素。其特点是无机机盐数量较低，适于生根培养。较低，适于生根培养。MSMS培养基培养基MillerMiller培养基培养基White培养基培养基SHSH培养基培养基B5培养基培养基N6培养基培养基KM-8P培养基培养基基本培养基基本培养基含较低的铵，硝酸盐和含较低的铵，硝酸盐和盐酸硫胺素用量较高。盐酸硫胺素用量较高。适合双子叶植物，适合双子叶植物， 尤其尤其木本植物组培木本植物组培。1968年由年由Galmborg等为培养大豆根等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较细

29、胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。物特别是木本植物。MSMS培养基培养基MillerMiller培养基培养基SHSH培养基培养基B5培养基培养基N6培养基培养基KM-8P培养基培养基White培养基培养基基本培养基基本培养基特点与特点与B5相似，相似，硫酸铵改用磷酸二氢硫酸铵改用磷酸二氢铵。铵。无机盐浓度较高。无机盐浓度较高。MSMS培养基培养基MillerMiller培养基培养基SHSH培养基培养基B5培养基培养基N6培养基培养基KM-8P培养基培养基White培养基培养基基本培养基基本培养基成分简单成分简单硝酸钾和硫酸铵含量高硝酸钾和硫酸铵含量高适合花粉、花药培养适合花粉、花药培养1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较花药培养而设计的。其特点是成分较简单，简单，KNO3和（和（NH4）2SO4含量高。含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其在国内已广泛应用于小麦、水稻及