肝素在人肝癌裸鼠转移模型中对肿瘤生长转移的影响

1、    肝素在人肝癌裸鼠转移模型中对肿瘤生长转移的影响        【摘要】 目的 观察肝素对肝细胞癌(HCC)生物学特性的影响。方法 构建裸鼠肝癌转移模型40例，分肝素、抑肽酶和止血芳酸干预治疗组、生理盐水对照组，比较肿瘤生长、转移和宿主生存。用免疫组化方法和酶活性检测方法，检测实验各组血浆和肿瘤组织中尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)和纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)的变化。结果 干预治疗30天肝素治疗组与对照组比较，肿瘤直径为1.50±0.61cm比2.98

2、±0.50cm(P<0.001)；肿瘤腹壁浸润率为20%比100%(P<0.05)；肺转移率为20%比60%；50天生存率为60%比0。其他治疗组与对照组比较结果差异无显著性。免疫组化和PAI-1活性检测结果表明：肝素治疗组肿瘤组织中uPA和PAI-1阳性率低于对照组，PAI-1活性有降低趋势。结论 在肝癌转移模型中，肝素有抑制肿瘤生长、抑制肿瘤浸润转移和提高宿主生存期的作用。【关键词】 肝素 肝细胞癌 肿瘤侵袭 纤溶酶原激活物ROLE OF HEPARIN ON TUMOR GROWTH AND METASTASIS IN MODEL OF HUMAN HEPATOCE

3、LLULAR CARCINOMA IN NUDE MICEZheng Qi, Tang Zhaoyou, Xue Qiong. Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032【Abstract】 Objective To observe the role of heparin in biological behaviour of hepatocellular carcinoma (HCC). Methods 40 nude mice with LCI-D20 met

4、astatic model of human HCC (MMHCC) were established. Heparin, aprotinin and aminomethylbenzoic acid were used for test to intervene HCC progression in MMHCC, and to compare with the saline control. The changes of plasminogen activator (uPA) and its inhibitor (PAI-1) were determined by PAI-1 activity

5、 kit and immunohistochemistry with monoclonal antibody against uPA and PAI-1. Results When the heparin-treated group was compared to the control group after treating for 30 days, tumor size was 1.50±0.61cm vs 2.98±0.50cm(P<0.001), tumor local invasion rate was 20% vs 100% (P<0.05), l

6、ung metastasis rate was 20% vs 60% and 50 days survival rate was 60% vs 0 respectively. Conclusion Our investigation suggested that heparin could not only inhibit tumor growth, but also inhibit tumor invasion and metastasis, and improve host survival in MMHCC. 【Key words】 Heparin Hepatocellular carc

7、inoma Neoplasm invasiveness Plasminogen activator肝素有抑制肿瘤血管生成作用1，肝素与抗肿瘤新药苏拉明(suramin)体内分解有效产物硫酸乙酰(heparan sulfate)的结构和功能相似2。在LCI-D20人肝癌裸鼠转移模型（简称肝癌转移模型）中选用肝素作为干预治疗剂，观察肝素对肝细胞癌(HCC)生物学特性的影响。材料与方法取肝癌转移模型作癌株供体，用BALB/CA裸小鼠构建肝癌转移模型40例，每组10只随机分成4组，分别作为对照组(0.2ml, 皮下)、抑肽酶(2000U/ml, 腹腔)、止血芳酸(10mg/ml，腹腔)和肝素治疗组(1

8、000U/ml，皮下)。模型建立24小时后每天给药一次。治疗后30天每组解剖5只，取血浆、肿瘤组织、腹壁浸润灶和肺，分别蜡块包埋和-70冻存，常规病理检查，检测AFP，用uPA和PAI-1单克隆抗体（工作浓度：1:400，免疫组化ABC法)检测肿瘤组织中uPA和PAI-1抗原蛋白表达。用PAI-1试剂盒（上海医科大学分子遗传学研究室提供）检测血浆和肿瘤组织中PAI-1活性变化。各组剩余5只继续治疗比较50天生存率。POMS软件统计处理（t检验和卡方检验）。结 果肝素治疗结果见表1，PAI-1活性检测、免疫组化结果见表2。结果表明：干预治疗30天时，对照组、抑肽酶和止血芳酸治疗组AFP、肝肿瘤大

9、小、肿瘤腹壁浸润和肺转移各指标与同期肝癌转移模型特征基本相符。提示上述各药对肝癌生长转移无明显影响。肝素治疗组与对照组比较，肝肿瘤直径为1.50±0.61cm比2.98±0.50cm, P<0.001；肿瘤腹壁浸润率为20%比100%，P<0.05；肺转移率为20%比60%。两组50天生存率比较为0%比60%。免疫组化结果表明肝素治疗组肿瘤组织uPA和PAI-1免疫染色阳性率要低于对照组，PAI-1活性检测结果提示，肝素治疗组有降低趋势，但与其他对照组比较差异无统计学意义。讨 论Stein等2于1989年报道了抗癌新药苏拉明，认为该药有独特的抗癌机制，即提出了抗

10、凝治疗与肿瘤缩小的观点。研究表明苏拉明能与转化生长因子(TGF)结合，从而有抑制肿瘤生长的作用。该药在体内分解代谢主要产物是硫酸乙酰，硫酸乙酰能与细胞外基质中层粘蛋白(laminin)结合，阻断肿瘤生长因子和血管生长因子促肿瘤生长的作用。Thorpe等1也曾报道肝素与类固醇偶合剂HAH联合应用有抑制肿瘤血管生成的作用。结果表明，肝素在肝癌转移模型中能抑制肿瘤生长，延缓肿瘤浸润转移和提高肿瘤宿主生存期，这可能与肝素抑制肿瘤血管生成作用有关。Bohrendt等3报道了小剂量的苏拉明有抑制uPA与uPA-R特异结合的作用，从而抑制肿瘤的侵袭性，并在抗癌治疗中取得了良好的效果。肝素是否也有类似作用呢？

11、结果提示肝素治疗与对照组比较肿瘤腹壁浸润和肺转移率降低，宿主50天生存率明显提高。免疫组化结果表明，肝素治疗后uPA和PAI-1在肿瘤组织中的表达有降低趋势，提示肝素可能有类似苏拉明抑制uPA激活的作用。实验还发现，肝癌转移模型裸鼠在肿瘤晚期阶段血浆中PAI-1活性明显升高。实验结果还表明肝癌转移模型裸鼠体内PAI-I活性经肝素治疗后有下降趋势，提示肝素可能有拮抗PAI-1的作用，由于实验中并未发现其他抗凝药物有抑制肿瘤侵袭性作用，提示肝素抗肿瘤作用主要和其药物分子结构有关，关于肝素抗肿瘤潜能和机制有待进一步开发和研究。本课题受上海市领先学科基金和美国中华医学基金会（CMB93-583）资助作

12、者单位：200032上海医科大学中山医院、肝癌研究所（郑起现在上海市第六人民医院普外科）参 考 文 献1 Thorpe PE, Derbyshire EJ, Andrade SP, et al. Heparin-steriod conjugates: new angiogenesis inhibitors with antitumor activity in mice. Cancer Res, 1993, 53: 3000-3009.2 Stein CA, Larocca RV, Thomas R, et al. Suramin: an anticancer drug with a uniqu

13、e mechanism of action. J Clin Oncology, 1989, 7: 499-508.3 Bohrendt N, Ronne E, Dano K. Binding of the urokinase-type plasminogen activator to its cell surface receptor is inhibited by low doses suramin. J Biol Chem, 1993, 268: 5985-5989.表1 各组实验结果比较药物动物数AFP(ng/ml)肿瘤大小腹壁浸润灶(cm)肺转移大小(cm)50天生存生理盐水5558.

14、64±287.162.98±0.500.74±0.463/50/5抑肽酶5660.81±177.083.10±0.550.62±0.234/50/5止血芳酸5595.14±231.123.02±0.110.70±0.213/50/5肝素5513.96±331.511.50±0.61*0.2*1/53/5*肝素组与各组比较P<0.05 表2 干预实验PAI-1活性及免疫组化结果比较组别动物数PAI-1活性免疫组化血浆PAI-1(Au/ml)*肿瘤PAI-1(Au/mg)*uPA(+)PAI-1(+)对照组1013