内分泌型隐睾动物模型的建立和比较

1、    内分泌型隐睾动物模型的建立和比较作者：张佐良 ，丁强 ，杨鲲 ，李强 ，张鹏 ，李映川    作者单位：上海市杨浦区老年医院泌尿外科，200090;上海复旦大学附属华山医院泌尿外科，200040【摘要】  目的 通过建立内分泌型隐睾动物模型，改进传统隐睾动物模型的不足，创建一种与临床表现相近可以研究隐睾与不育的关系的动物模型。 方法 本实验中使用Sprague-Dawley大鼠，大鼠分为4组:A组（n=28只）内分泌型隐睾组:孕大鼠于孕龄1517d注射氟他胺（剂量100mg/kg）产下的隐睾仔鼠，未出现隐睾

2、的做为药物对照组B组（n=30只）机械法隐睾组:新生期仔鼠切断睾丸引带，将睾丸放入腹腔内结扎鞘膜腔，使睾丸保留在腹腔内。C组（n=15只）药物对照组:经氟他胺处理未出现隐睾的雄鼠。D组（n=30只）正常对照组。上述各组又随机分为3组，分别于30d、60d和90d处死，检查外生殖器和睾丸、附睾的发育情况，称睾丸重量。组织学检查曲细精管直径、Johnson评分和生精上皮计数（CMSE）。 结果 内分泌型隐睾组32只，其中双侧隐睾4只，单侧隐睾28只。交配实验结果显示:A组受孕实验为阴性，受孕率为60%。B组和D组均为阳性，受孕率为100%。C组有9只受孕实验为阳性，受孕率为90%（P<0.0

3、5）。组织学上，隐睾侧睾丸在性成熟后表现为曲细精管直径减小、Johnsen评分下降和生精上皮细胞计数减少、缺少精子。 结论 通过对氟他胺诱导的（内分泌型）和传统的手术导致（机械法）2种隐睾动物模型的比较，可以看出内分泌型隐睾动物模型比机械法隐睾动物模型更接近于临床上所出现的隐睾，该模型是一种与临床表现相近可以研究隐睾与不育的关系的动物模型。【关键词】  内分泌;动物模型;隐睾隐睾是生殖泌尿系统先天性异常中最常见的疾病，新生儿的发病率约为1%2%。隐睾的病理主要是生殖细胞发育障碍，因此影响生育能力1 。传统的试验动物单侧隐睾模型是腹腔内睾丸，而儿童隐睾症多数睾丸停留在腹股沟或Brown

4、's囊内，腹腔内型隐睾仅为5%左右，且生育力与正常对照无显著差别2 。因此，建立一种与临床表现相近可以研究隐睾与不育的关系的动物模型有着重要的意义。本研究旨在通过建立内分泌型隐睾动物模型，改进传统隐睾动物模型的不足，创建一种与临床表现相近可以研究隐睾与不育的关系的动物模型。1 材料与方法     1.1 材料  （1）试剂:氟他胺（Flutamide e）（纯剂）由上海复旦复华药业有限公司（原上海医科大学红旗制药厂）提供.。三油酸甘油酯（Triolein）100ml、无水乙醇（Ethanol）500ml，购自上海化学试剂采购供应站。将1

5、0ml无水酒精溶于三油酸甘油酯100ml中配成10%的酒精甘油酸三脂溶液。将600mg氟他胺溶于30ml溶液内，即配成2%浓度氟他胺溶液。（2）实验动物:Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重250400g，由复旦大学试验动物部提供，饲养环境为清洁级屏障系统。（3）试验设备:计算机图像分析系统（CMIAS-2000病理图象分析系统，北京航空航天大学）1.2 方法    1.2.1 隐睾动物模型的制备  （1）内分泌型隐睾动物模型的制备:取孕15d（阴道内发现精子为受孕第1天）的SD孕大鼠16只，将浓度为2%的氟他胺溶液按100mg/kg的剂量，皮

6、下注射3d（即1517d）。待仔鼠出生后，挑选出雄性仔鼠。出生后25d断奶，28d开始检查睾丸位置，选出有隐睾的幼鼠分组为内分泌型隐睾组。未出现隐睾的幼鼠作为药物对照组。（2）机械法隐睾动物模型的制备:日龄20d的雄性SD孕大鼠30只，在2%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔麻醉下，取腹正中切口，切断右侧睾丸引带，将睾丸推入腹腔，用1-0丝线结扎鞘膜腔使睾丸保留在腹腔内，分层关腹。     1.2.2 动物分组  （1）内分泌型隐睾组（A组）:32只，其中双侧隐睾4只，单侧隐睾28只随机分为3组，各组分别为8、10、10只。（2）机械法隐睾动物模

7、型组（B组）30只。（3）药物对照组（C组）15只。（4）正常对照组（D组）30只。     1.2.3 标本收集  各组于术后30、60、90d称体重后，2%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔麻醉，检查睾丸位置、大小、附睾畸形程度、称裸睾重量。睾丸标本一部分，迅速至液氮中冷却-70保存用以测定RT-PCR。其余部分保存在10%中性甲醛中固定，石蜡包埋做5m、HE染色切片供光镜观察。观察项目:除进行睾丸的一般病理检查外，还观察以下量化指标:（1）生精上皮细胞计数（CMSE）即计算曲细精管半径上的细胞层数。（2）Johnsen's评分。（3

8、）用图象分析仪定量测定法测定曲细精管平均直径（MID）:计算每个标本50个曲细精管横断面的计算平均直径。     1.2.4 交配试验  各组鼠于90d日龄与成年雌鼠交配。取各组90d日龄鼠5只，每只雄鼠与2只随机选择的90d日龄雌鼠合笼喂养2周，计数致孕雄鼠、受孕雌鼠数。     1.3 统计学方法  采用Spss11.0软件包，组间比较用t检验。统计显著意义设定为P<0.05。2 结果     2.1 隐睾的位置、睾丸的重量、体积变化和附睾畸形程

9、度  在内分泌型隐睾位于腹股沟区，有4只附睾畸形，而机械法隐睾位于腹腔内无附睾畸形。正常对照组和药物对照组鼠睾丸均位于阴囊内，药物对照组有2只附睾畸形。睾丸重量和容积见表1、表2。表1 各组鼠不同时期睾丸的容积（cm3 ）比较（略）表2 各组鼠不同时期睾丸的重量（g）比较（略）结果显示:各组鼠睾丸重量、体积在30d日龄差异无显著性（P>0.05）但在60、90d日龄组中隐睾与正常位置睾丸差异有非常显著性（P<0.01）。     2.2 睾丸组织结构改变  A组60、90日龄大鼠中隐睾对侧睾丸有6例无精子，B组中均有精子。

10、组间检测差异有显著性（P<0.05）。     2.2.1 各组鼠生精上皮细胞计数（CMSE）  见表3。表3 各组鼠生精上皮细胞计数（略）通过比较分析，隐睾侧生精上皮细胞计数（CMSE）与正常睾丸比较在30d差异无显著性，但在60d、90d差异有非常显著性（P<0.01）。A组与B组比较组间差异无显著性（P>0.05）。     2.2.2 Johnsen's评分  光镜下按以下标准评分。1分:完全透明变性，曲细精管内无细胞可见;2分:仅有支持细胞，无生精细胞;3分:

11、仅有精原细胞;4分:极少量精母细胞;5分:仅有少量精母细胞;6分:无精子，仅少许精子细胞;7分:无晚期精子细胞，仅有少量早期精子细胞;8分:仅少量晚期精子细胞;9分:有很多晚期精子细胞，但排列混乱;10分:完好的精子发生。各组Johnsen's评分统计见表4。表4 各组Johnsen's评分（略）2.2.3 各组鼠曲细精管平均直径（MID）比较  见表5。表5 各组鼠睾丸曲细精管平均直径比较（略）2.3 各组鼠交配试验结果  见表6。     表6 各组鼠交配试验结果统计（略）组间比较:内分泌组隐睾受孕率明显低于其他各

12、组（P<0.05），机械法隐睾动物模型与正常对照组和药物对照组之间差异无显著性（P>0.05）。     3 讨论     隐睾是生殖泌尿系统先天性异常中最常见的疾病。在美国每年约进行27，000例隐睾下降固定术，是最常见的外科手术之一1 。文献报道8/9的双侧隐睾患者最终发展为无精子症，经药物和手术治疗仍有32%和46%的无精子症的发生率。而单侧隐睾无论是药物或手术治疗最终仍有13%的患者发展为无精子症，进而引起男性不育3 。临床上儿童隐睾症多数睾丸停留在腹股沟或Brown's囊内，腹腔内型隐

13、睾仅为5%左右4 。传统的实验动物单侧隐睾模型是腹腔内睾丸且生育力与正常对照无显著差别2 。因此，建立一种与临床表现相近可以研究隐睾与不育的关系的动物模型有着重要的意义。    早在20世纪30年代Engle就提出下丘脑-垂体-睾丸轴在睾丸下降中起着重要作用的理论。雄激素在正常的睾丸下降过程中的重要作用，已得到公认，阻断5还原酶或雄激素受体可抑制睾丸下降出 现隐睾5 。Hutson通过动物实验证实:睾丸经腹股沟管降至阴囊内的过程依赖于睾丸酮，而且通过生殖股神经间接对睾丸引带起作用。在雄激素的刺激下，生殖股神经核释放降钙素基因相关肽（calcitonin gene-

14、related peptide CGRP）后者刺激细胞内cAMP释放，使睾丸引带发生节律性收缩6 。Cain发现在大鼠胚胎期1617d天正是睾丸引带形成时间，在此时阻断雄激素可以改变睾丸引带和生殖股神经的形态，出现隐睾。提示胚胎期雄激素的缺乏是导致隐睾的重要因素7 。在本内分泌型隐睾动物模型组中，32只隐睾大鼠中，35只睾丸位于腹股沟区，睾丸引带发育不全且与腹股沟周围组织有不同程度的黏连。因此，睾丸无法下降到阴囊内而出现隐睾。由于大鼠的精原细胞在胚胎期1314d，精细胞有丝分裂停止，这种现象一直维持到出生后34d。因此，此时阻断雄激素不会对生殖细胞的发育造成影响，故在本药物对照组精细胞没有出现

15、发育障碍，与正常对照组差异没有显著性（P>0.05）。可以排除药物对生殖细胞的影响。在隐睾中由于异位的睾丸处于高于阴囊温度的环境中，因此导致不同程度的精细胞发育障碍8 。在机械法隐睾模型中，由于睾丸位于腹腔内受温度影响较大故损伤较重。通过光镜观察，虽然机械法隐睾动物模型大鼠的隐睾侧曲细精管较内分泌型隐睾组无明显减小，但生精上皮细胞计数（CMSE）明显低于内分泌型组（P<0.01）。提示睾丸局部环境温度的变化是影响生殖细胞发育的重要因素之一。    以往资料多集中在讨论早期阻断雄激素和隐睾下降的关系，但对该模型出生后的长期病理改变和不育的关系却没有涉及8

16、9 。本研究发现内分泌型单侧隐睾对生育是有影响的，这种影响除隐睾本身的病变外，还受对侧降入阴囊内睾丸与附睾的发育与成熟程度的影响。因此，对侧睾丸的精子发育成熟程度和附睾有无畸形也是影响单侧隐睾生育的重要因素。在机械法隐睾动物模型中，对侧睾丸在隐睾发生初期对侧睾丸出现代偿型增大，表现为生精细胞、支持细胞和间质细胞有不同程度的增大，从而出现睾丸体积、重量增加，与正常对照组比较睾丸体积、重量明显增大。在代偿的后期（90d），睾丸的重量、体积和曲细精管的直径则与正常对照组无显著差异。内分泌型隐睾模型组也有同样的现象。尽管有文献报道，机械法隐睾代偿后期可以出现曲细精管萎缩、细胞排列松散5 。但大多数文献

17、报告对侧睾丸无明显的损伤且受孕试验显示与正常对照无显著差异4，8 。本研究也观察到机械法隐睾动物模型组交配试验结果与正常对照组差异无显著性（P>0.05），对侧睾丸精子发育良好，无法说明隐睾与不育的关系。但临床资料显示，单侧隐睾对侧睾丸的生殖指数却是降低的10 。在内分泌型隐睾动物模型中，交配试验结果与正常对照组差异有显著性（P<0.05）。在内分泌型隐睾动物模型组中，除可以观察到睾丸的代偿性变化、大部分睾丸有正常精子形成外，在6例隐睾模型的对侧睾丸还观察到睾丸内尽管生精上皮细胞计数（CMSE）无明显减少，但Johnsen's评分较低（56分）、精细胞减少、睾丸内无精子，且

18、有4例单侧隐睾存在着附睾畸形。而临床上附睾畸形在隐睾病例中也有一定比例在3050%之间1112 。而对侧睾丸附睾与睾丸附着变异及梗阻的存在，即使对侧睾丸生殖细胞发育正常也无法将成熟的精于向外输送，从而也可导致不育。    总之，通过对氟他胺诱导的（内分泌型）和传统的手术导致（机械法）2种隐睾动物模型的比较，我们可以看出内分泌型隐睾动物模型比机械法隐睾动物模型更接近于临床上所出现的隐睾，因此该模型是一种与临床表现相近可以研究隐睾与不育的关系的动物模型。【参考文献】    1 Lee PA Fertility in cryptorchid

19、ism.Does treatment make adif-ference?JEndocrinol Metab Clin North Am.1993Sep，22（3）:479-90.2 Loveland KL，Schlatt S.Stem cell factor and c-kit in the mam-malian testis:lessons originating from Mother Nature's gene knockoutsJ.Endocrinol1997;153（3）:337-44.3 Hadziselimovic F，Herozog B.Importance of e

20、arly postnatal germ cell maturation for fertility of cryptorchid malesJ.Horm Res2001，55（1）:6-10.4 Huff DS，Hadziselimovic F，Snyder HM，et al Postnatal testicu-lar maldevelopment in unilateral cryptorchidism J.J Urol1989，142（2pt2）:546.5 Husmann DA，McPhaul MJ.Time-specific androgen blockade with flutami

21、de inhibits testicular descent in the ratJ.En-docrinology，1991;129（3）:1409-1416.6 Agarwala S，Mitra DK Fertility and unilateral undescended testis in the rat modelJ.Pediatr Surg Int.1996，11:266-268.7 Cain MP，Kramer SA，Tindall DJ et al Flutamide-induced cryp-torchidism in the rat is associated with altered gubernacular morphologyJ.Urology，1995，46（4）:553-558.8 Berkowitz GS，Lapinski RH，Dolgin SE，e