新型混合取代环糊精毛细管电泳对药物的手性分离

1、新型混合取代环糊精毛细管电泳对药物的手性分离应津津1，梅洁1，肖玉秀1作者简介：应津津，女，硕士研究生 * 通讯作者：肖玉秀，女，教授 Tel: (027) 68759990 E-mail: yuxiuxiao，任勇2（1.武汉大学药学院，武汉430072；2.南京师范大学药物超分子材料及应用实验室，南京210046）药物超分子材料及应用实验室摘要:目的考察新型混合取代环糊精衍生物羟丙基-磺丁基-b-环糊精(HP-SBE-b-CD) 对四种碱性药物的对映体分离，并比较其与单一取代环糊精衍生物手性识别能力的强弱。方法采用毛细管区带电泳模式，研究HP-SBE-b-CD对手性药物的拆分，探讨环糊精浓

2、度和取代度、缓冲液的pH值和浓度、有机改性剂含量以及分离电压对碱性药物对映体手性分离的影响；比较HP-SBE-b-CD、羟丙基-b-环糊精 (HP-b-CD) 与磺丁基-环糊精 (SBE-b-CD) 手性拆分能力的强弱。结果电泳条件为Tris-磷酸盐缓冲液(pH 2.5, 60 mmol·L 1)，运行电压18 kV，有机改性剂甲醇含量15%时，四种碱性药物达到较好分离；手性识别能力大小SBE-b-CD > HP-SBE-b-CD > HP-b-CD。结论本实验对HP-SBE-b-CD手性拆分的初步探究可为混合取代环糊精衍生物的应用和具有高手性分离能力的衍生化环糊精的合成

3、提供重要依据。关键词: 手性分离；羟丙基-磺丁基醚-b-环糊精；毛细管电泳；结合常数Chiral separation of drugs by capillary electrophoresis with a new mixed-substituted cyclodextrinABSTRACT: OBJECTIVE To investigate the enantioseparation of four basic drugs using capillary electrophoresis (CE) with a new mixed-substituted derivative of cycl

4、odextrin，hydroxypropyl-sulfobutylether-b-cyclodextrin (HP-SBE-b-CD), and compare the chiral recognition ability of HP-SBE-b-CD with that of mono-substituted derivatives. METHODS The effects of concentration and substitution degree (SD) of HP-SBE-b-CD, concentration and pH value of electrophoretic bu

5、ffer, the organic modifier, separation voltage on enantioseparation of basic drugs were investigated; also, the chiral separation abilities of HP-SBE-b-CD, hydroxypropyl-b-cyclodextrin (HP-b-CD) and sulfobutylether-b-cyclodextrin (SBE-b-CD) were compared. RESULTS Good separation was achieved under t

6、he following conditions: running buffer, 60 mmol·L 1 Tris-phosphate buffer(pH 2.5); running voltage , 18 kV ; organic modifier, 15% methanol (v/v). The ability of chiral separation: SBE-b-CD > HP-SBE-b-CD > HP-b-CD. CONCLUSIONThe initial investigation on the new HP-SBE-b-CD was carried ou

7、t, providing import basis for the application of mixed-substituted CD derivatives and the synthesis of new CD derivatives with high chiral recognition ability. KEY WORDS: chiral separation; hydroxypropyl-sulfobutylether-b-cyclodextrin; capillary electrophoresis; binding constant环糊精 (CD) 及其衍生物是毛细管电泳

8、(CE) 中最常用的手性选择剂1。相比于天然环糊精，环糊精衍生物在水溶性和与客体分子的配位能力上有很大提高，而且带电环糊精能分离电中性和带电的手性药物。因此，改性环糊精用于手性药物的拆分研究是一项具有挑战意义的课题。目前大部分的环糊精衍生物是单一取代基产物，近年来又发展出混合取代基衍生物的制备方法。新合成的羟丙基-磺丁基-环糊精 (HP-SBE-CD) ，是将两种不同的亲水基团直接引入-环糊精的混合取代衍生物，水溶性好，包合药物能力较强2。为考察混合取代环糊精衍生物的手性拆分能力，本实验采用毛细管区带电泳模式，以HP-SBE-CD为手性选择剂分离四种碱性药物，探讨环糊精浓度及取代度、缓冲液pH

9、值及浓度、有机改性剂含量、电压等因素对药物对映体分离的影响，并从理论上对CZE环糊精手性拆分的主体选择性进行初步探讨。同时将该混合取代的环糊精与目前广泛使用的电中性的羟丙基-环糊精 (HP-CD)和负电荷的磺丁基-环糊精 (SBE-CD) 作比较，探讨三者的手性识别能力。1仪器与试剂CAPEL-105型毛细管电泳仪 (Lumex，俄罗斯)。外消旋体阿替洛尔、盐酸阿普洛尔、盐酸醋丁洛尔 (MP，法国)，盐酸普萘洛尔 (Sigma，德国)，三羟甲基氨基甲烷 (Tris-base，Amresco，美国)，HP-SBE-CD (取代度SD分别为HP：SBE = 6：1.5，5.5：3.0，3.4：3.

10、1，1.18：3.5)、HP-CD (SD = 2)、SBE-CD (SD = 6.4) (南京师范大学)，去离子水，其余试剂均为分析纯。2 实验方法2.1 溶液的配制Tris-H3PO4缓冲液：精密称取Tris，加水溶解完全，用磷酸调节pH至2.50，再以水定容至100 mL，得一定浓度的Tris- H3PO4缓冲液，备用。环糊精储备液：精密称取一定质量的各种环糊精，加水溶解完全，再以水定容至10 mL，配成浓度为50 mmol·L 1的环糊精母液，待用时用Tris- H3PO4缓冲液稀释。所有样品及缓冲溶液使用前均通过0.45 µm滤膜过滤并超声脱气。2.2 毛细管电泳

11、条件毛细管50 cm×50 m (有效长度41 cm)；操作电压18 kV；检测波长214或224 nm；压力进样30 mbar×5 s。两次运行间依次用0.l mol·L1 NaOH冲洗1 min，水冲洗1 min，电泳缓溶液冲洗2 min。两对映体之间的分离度Rs用下面公式计算： (1) 式中和代表两对映体的迁移时间，和代表两对映体的半峰宽。3 结果与讨论3.1 环糊精浓度对分离的影响实验考察了HP-SBE-CD (SD = 5.5:3.0) 浓度(0.5-16 mmol·L 1)对四种碱性药物分离的影响。结果表明，各药物对映体达到分离时所需的环糊精

12、浓度相差较大：普萘洛尔 < 阿普洛尔 < 阿替洛尔 < 醋丁洛尔；由于CD浓度的选择与它和药物形成的络合物的稳定常数有关，稳定常数越大，所需手性试剂的浓度越低；反之则越高，而稳定常数是衡量CD与药物结合能力大小的指标，由此可推断HP-SBE-CD与药物对映体包结能力强弱顺序为：普萘洛尔 > 阿普洛尔 > 阿替洛尔 > 醋丁洛尔，这可能与药物的结构有关3。普萘洛尔因分子结构中两个苯环显示出高亲油性，使其和环糊精间有更高的亲和力，以致药物与环糊精的疏水空腔匹配良好。阿普洛尔也有较高的分离度，因为邻位上的长碳链和普萘洛尔的第二个苯环有相似的空间相互作用。醋丁洛尔之

13、所以分离效果最差是因为对位上取代的长碳链阻碍分子与环糊精外围的基团相互作用，降低了络合物的稳定状态。本实验以阿替洛尔和醋丁洛尔为例，测定不同环糊精浓度下两个对映体的迁移时间，计算出对映体与环糊精的结合常数，从理论上对环糊精手性拆分的最佳浓度及主体选择性进行了初步探讨。设不加环糊精时两对映体的迁移率为，为结合物的迁移率，为经电流校正后两对映体的表观迁移率。 (2)由l/CD对作一直线，截距与斜率之比即为对映体与CD的结合常数K4。求得阿替洛尔的K1和K2值分别为56.7、62.3，醋丁洛尔的K1和K2值分别为44.6、47.5，并可粗略得出醋丁洛尔所需的最佳CD浓度 (约21.7 mmol

14、83;L 1) 比阿替洛尔所需的 (约16.8 mmol·L 1) 高(5)。由此可以看出，新合成的HP-SBE-CD与阿替洛尔对映体的结合常数较大，说明阿替洛尔与HP-SBE-CD空腔的匹配程度较好。3.2 缓冲液pH值对分离的影响研究了50 mmol·L 1 Tris-H3PO4电泳缓冲液pH值在2.5-7.0范围内变化时对药物手性拆分的影响。由图1可知，pH为2.5最适合这四种碱性药物的分离。在低pH情况下，电渗流很小，带负电的HP-SBE-CD与带正电的碱性药物作用时间增长，从而使对映体更好地分离。且此pH值接近H3PO4的pKa值 (2.1) ，缓冲溶液具有较大的

15、缓冲容量从而可减小在电泳过程中由电解作用所引起的pH变化。3.3 缓冲液浓度对分离的影响实验探究了Tris浓度变化 (20-100 mmol·L 1) 对药物手性分离的影响。当浓度为60 mmol·L 1时，药物的分离效果最好。在焦耳热可以忽略的情况下，增加缓冲液的浓度，则有更多正电的Tris+与毛细管壁上的硅羟基反应，可以降低电渗流，从而改善 Rs。但电解质浓度过高，焦耳热增加，分离度和柱效都降低。3.4 有机改性剂对分离的影响在毛细管电泳中，有机溶剂常作为改性剂添加到缓冲液中来改变分离。实验选用甲醇作为改性剂，探讨其含量（0-20%，v/v）对分离的影响。实验表明在缓冲

16、溶液中加适量的甲醇可以提高分离度，但当甲醇含量增大到20%时分离度降低。这是因为甲醇一方面与环糊精、对映体可能形成三元包合物，促进包合作用，有利于对映体的拆分；另一方面可能与对映体竞争选择剂，降低了选择剂-药物之间的络合作用力。因此，有机溶剂对药物对映体分离的影响取决于哪方面占主导地位。本实验以15%的含量为最佳。3.5 分离电压对分离的影响为了优化分离电压以达到良好的手性拆分效果，实验考察了15 kV-25 kV电压对手性分离的影响。随着分离电压增大，电场强度增大，离子的迁移速度增加，从而导致对映体与环糊精的相互作用时间缩短，分离度降低。且电压的升高，导致产生的焦耳热增多而降低分离度。综合考

17、虑迁移时间和分离度，18 kV为较优的分离电压。3.6 环糊精取代度对分离的影响环糊精衍生物的取代度不同，对手性药物的分离效果有很大差异6。实验选取了四种不同取代度的HP-SBE-CD，羟丙基：磺丁基的取代度分别为6:1.5，5.5:3.0，3.4:3.1，1.18:3.5，考察取代度对分离的影响。图2和表1显示连接到环糊精上的磺丁基基团的个数显著影响药物的手性分离。这是因为磺酸基团在很宽的 pH值范围内均解离带负电，磺丁基基团的个数增加，导致环糊精所带的负电荷增多，使环糊精与带正电荷的药物间静电作用力增强，分离度大大改善。另外，负电性的环糊精在毛细管电泳中的电泳迁移方向与电渗流相反，随着取代

18、度变化，环糊精的有效负电荷增加，其电泳迁移率减慢，与药物结合后迁移时间明显延长。3.7 与其它环糊精衍生物的比较本实验将新型的HP-SBE-CD (SD：HP：SBE =3.4:3.1) 与已普遍使用的中性HP-CD (SD = 2) 、负电性的SBE-CD (SD = 6.4) 作为手性添加剂，比较单一取代与混合取代环糊精衍生物的手性识别能力。当阿替洛尔被成功分离时 (分离度为1.06)， 所需的HP-SBE-CD和SBE-CD浓度分别为8 mmol·L 1、2 mmol·L 1；醋丁洛尔分离度为1.20时，需要16 mmol·L 1 HP-SBE-CD或3 m

19、mol·L 1 SBE-CD。而HP-CD浓度达到16 mmol/L仍无法分离对映体。因此可以初步判断对碱性药物对映体的手性拆分能力强弱为SBE-CD > HP-SBE-CD > HP-CD。手性识别能力的差别主要与环糊精的带电荷数及结构有关。前两者分子中均含磺丁基，使环糊精带负电，与带正电荷的药物分子之间存在静电作用力；负电的环糊精电泳迁移率与电渗流反向，分析窗口增大，药物与环糊精的作用时间延长，有利于对映体的分离。因此带电的手性选择剂在选择性上较电中性的手性选择剂更为有效。在总取代度相同的前提下，羟丙基和磺丁基存在竞争关系，相当于羟丙基取代了一部分磺丁基而由SBE-C

20、D衍变为HP-SBE-CD，环糊精分子所带的有效电荷数减小，与药物的静电作用力减弱，手性识别能力减小。而且被磺丁基取代与被羟丙基取代相比环糊精分子的口径更大，可使客体分子更容易与环糊精形成包合物，这就使SBE-CD对对映体的分离选择性更高。根据上述分析推断：若保持HP-SBE-CD与SBE-CD中磺丁基的取代度一致，则HP-SBE-CD中羟丙基的取代可能通过氢键等作用改变环糊精的空腔大小及环糊精与磺丁基、缓冲液等相互作用而显示截然不同的分离能力。由于实验室HP-SBE-CD的取代度有限，目前未能开展实验来验证该推论，有待日后进一步研究。本实验对HP-SBE-b-CD手性拆分能力的初步探究可为混

21、合多取代环糊精衍生物对药物对映体的分离提供理论依据，并为合成具有高手性分离能力的衍生化环糊精提供一定的参考。参考文献1 Vespalec R, Boek P. Chiral Separations in Capillary Electrophoresis J. Chem Rev, 2000, 100:3715-3753.2 Nanjing Normal University. Hydroxypropyl-sulfobutyl-b-cyclodextrin, the preparation method, the analytical method and the pharmaceutical

22、application thereof:World, WO 2007/051358 A1 P. 2007-05-10.3 Vargas M G, Heyden Y V, Maftouh M, et al. Rapid development of the enantiomeric separation of b-blockers by capillary electrophoresis using an experimental design approach J. J Chromatogr A, 1999, 855:681-693.4 Salvador, Varesio E, Dreux M, et al. Binding constant dependency of amphetamines with various commercial methylated beta-cyclodextrinsJ. Electrophoresis, 1999, 20:2670-2679.5 Lin X L, Zhu C F, Hao A Y. Evaluation of newly synthesized derivative of cyclodextrin for the capil