植物组织培养与细胞培养

1、植物组织培养与细胞培养开始于19世纪后半叶，当时植物细胞全能性的概念还没有完全确定，但基于对自然状态下某些植物可以通过无性繁殖产生后代的观察，人们便产生了这样一种想法即能否将植物体的一部分在适当的条件下培养成一个完整的植物体，为此许多植物科学工作者开始了培养植物组织的尝试。最初的问题仍然是集中在植物细胞有没有全能性和如何使这种全能性表现出来。 1839年Schwann提出细胞有机体的每一个生活细胞在适宜的外部环境条件下都有独立发育的潜能。1853年trecul利用离体的茎段和根段进行培养获得了愈伤组织，愈伤组织是指一种没有器官分化但能进行活跃分裂的细胞团，但这还不能证明细胞具有全能性，因为由愈

2、伤组织没能再生出完整植物体。1901年Morgan首次提出一个全能性细胞应具有发育出一个完整植株的能力。所谓全能性细胞就是指具有完整的膜系统和细胞核的生活细胞，在适宜的条件下可通过细胞分裂与分化，再生出一个完整植株。White指出：如果一个给定的有机体的所有细胞都大致相同，并具有全能性，那么在有机体内所观察到的细胞分化必定是这些细胞对有机体内微环境和周围环境的反应。就是说机体内每个细胞所以没有表现出全能性，是因为该细胞所处位置的不同，致使其某些功能被抑制（suppressed),这充分说明机体内的微环境因素在细胞分化中起了十分重要的作用。按照现代发育生物学和细胞生物学的理论，细胞分化是受基因在

3、时间和空间两个方面的调空，空间就是指细胞在机体内所处的位置。不同位置的细胞，其基因的表达不同，细胞所表现出的形态结构和行为就不同。如果将一个生活的细胞从植物体内分离出来，使之脱离开原有的环境，细胞被抑制的功能将有望得以恢复，重新表现出全能性。基于这种认识，科学工作者便萌生出了植物组织培养的念头。 Haberlandt(1902)首次提出细胞培养的概念，也是第一个用人工培养基对分离的植物细胞进行培养的人。与rechinger不同，Haberlandt相信切块大小不会影响细胞增殖，但由于Haberlandt使用的培养液成分简单，培养的细胞是高度分化的细胞，又没采取消毒技术，所以实验失败，培养的细胞

4、虽然存活了几个月但没能分裂。Haberlandt转而对损伤修复发生兴趣，提出激素作用的概念（leptohormone)，与维管组织特别是韧皮部有关；另一类是创伤激素(woundhomone)，与细胞损伤有关，为后来激素理论的建立和在组织培养中的广泛应用奠定了基础。但自Haberlandt的实验之后直到1934年White培养番茄离体根尖的成功，其间的30多年里，植物组织培养技术几乎没有什么进展。分析其原因，主要就是培养基的成分和实验所选取的材料不够合适。 1934年White用离体的番茄根建立了第一个活跃生长的无性系，使根的离体培养实验首次获得了真正的成功，并首次发现和提出B族维生素B1、维生

5、素B6和烟酸的重要性。与此同时，Cautheret在山毛柳和黑杨形成层组织的培养中也发现了B族维生素的作用，并使培养获得了成功。Nobecourt也用胡萝卜建立了类似的连续生长的组织培养物。因此，Haberlandt、White和Nobecourt一起被誉为植物组织培养的奠基人。人们现在所用的若干培养方法和培养基，原则上都是他们在1939年所建立的方法和培养基演变的结果，几乎所有的培养基中都添加了不同种类和不同数量的B族维生素。从此植物组织培养进入快速发展时期。1941年，Overbeek、Conklin和Blakeslee等用附加椰乳到培养基中，获得了Datura离体胚培养的成功。椰乳成分复

6、杂，含有多种不同的有机物，后来的研究发现，其中在组织培养中起主要作用的是腺嘌呤类激素或类似物。1944年，Skoog报道DNA的降解产物腺嘌呤和腺苷可以促进愈伤组织的生长，解除生长素对芽形成的抑制作用，诱导芽的形成。1948年，Caplin和Steward用实验证明椰乳与2,4-D配合，对培养的胡萝卜和马铃薯组织的增殖起到明显的促进作用。在用烟草髓细胞诱导愈伤组织的实验中，Skoog,Miller等分离确定了6-呋喃氨基嘌呤对细胞分裂有促进作用，并命名为“激动素”（Kinetin)。之后，与此相关的同系物6-苄氨基嘌呤被合成，它也刺激培养物的细胞分裂。于是，出现了“细胞分裂素”这一集合名词，专

7、门用来指能刺激培养物细胞分裂的一组6-某基团的氨基嘌呤化合物。尔后，玉米素、异戊烯基腺嘌呤和其他细胞分裂素等植物激素的相继发现，更增加了细胞分裂素的种类。由于发现生长素和细胞分裂素相互配合能调节细胞的分裂与分化，控制器官的分化，生长素高时可诱导根的形成，细胞分裂素高时可促进芽的分化，使植物组织培养的工作迅速取得突破。1958年美国的Steward和德国的Reinert分别由培养的胡萝卜细胞诱导形成了胚状体，1965年由Vasil和Hildebrandt用单个分离的细胞培养获得整个植株的再生，从而使植物细胞全能性的理论真正得到了科学的证实。从此之后，一批又一批植物的组织或器官通过培养的方法获得了

8、再生植株。 20世纪60年代，在植物组织培养方面的另外两项成就就是划分小孢子培养和原生质体培养的成功。Guha和Maheshwari（1966，1967），Rourgin和Nitsch（1967）先后利用烟草和胡萝卜的小孢子培养获得单倍体植株，并成功地实现了染色体的加倍，使这种同源二倍体植株在5个月内收获到种子。Cocking等用纯化的纤维素酶和果胶酶处理烟草细胞，获得原生质体，通过调节渗透压的方法控制原生质体膨胀，使培养获得成功，得到了再生植株。自20世纪60年代始，植物组织与细胞培养逐渐走向了工厂化和商品化阶段。 现在已不能确切统计有多少种植物通过组织培养的方法获得了再生植株，因为几乎每天

9、都有可能出现利用新的植物种类获得培养成功的报道。植物组织培养已经变成了一种常规的实验技术，广泛应用于植物的脱毒、快繁、基因工程、细胞工程、遗传研究、次生代谢物质的生产、工厂化育苗等多个方面；从高级的研究机构、大专院校到普通的生物技术公司，甚至农民专业户都在不同程度的利用或开展组织培养工作。 植物组织培养已经走过了近百年的历程。它的历史不仅证明了植物的每一个生活细胞都含有一种植物的全部遗传信息，在一定的条件下可以发育成一个完整的植株，而且在一定范围内人们可以按照意愿，改变和调节植物的发育。但这种调节和改变知识局部的，主要是通过改变培养基中的激素和培养条件，从遗传基础上的彻底改造仅仅是开始。但是，

10、生命的奥秘是很深远的，植物也如此，科学家至今仍不能实现对所有植物的组织培养再生，对基因型对组培成功的影响至今仍迷惑不解，而且对已经获得成功的植物，也还是有很多问题没有解决。即便像烟草和拟南芥这样的模式植物，也没能实现让它们在组培容器中遂愿的生长发育和开花结实。人们对植物的认识、了解和掌握，仍然处于必然王国阶段，单就其组织培养而言，还有十分漫长的道路要走。 编辑本段植物组培的应用前景1、快速繁殖某些稀有植物或有较大经济价值的植物 依靠自然条件在较短时间内繁殖稀有植物和经济价值较高的植物，受到地理环境和季节的限制，很难达到快速、高效的目的；特别对于在短时期内需要达到一定数量，才能创造应有价值的植物

11、，时间就是效益，只有通过组织培养的方法才能满足这一要求。 用组织培养法繁殖植物，这是组织培养应用于生产的主要的和成效最大的实例。首先是在兰花上的成功应用。自Morel在1960年得到兰花组织培养苗后，很快应用于生产，形成了组织培养法繁殖兰花工业。 由于组织培养法繁殖植物的明显特点是快速，每年可以数以百万倍速度繁殖，因此对一些繁殖系数低，不能用种子繁殖的名特优植物品种的繁殖，尤为意义重大。 2、脱毒 植物中有很多都带有病毒，严重影响植物的产量和品质，给农业带来灾害。特别是无性繁殖植物，如马铃薯、草莓、大蒜、康乃馨等，由于病毒是通过维管束传导的，因此利用这些植物营养器官繁殖，就会把病毒带到新的植物

12、个体上而发生病害。但是也证明感病植株并不是每个部位都带有病毒，如茎尖生长点尚未分化成维管束的部分，可能不带病毒。若利用组织培养法进行茎尖培养，再生的植株有可能不带病毒，从而获得脱病毒的苗，再用这种苗进行繁殖，则种植的植物就不会或极少发生病毒病。 所获得的脱毒苗一定要经过鉴定，确认不带病毒才能使用。使用组织培养法获得脱毒苗已经在草莓、葡萄、康乃馨等获得成功，产生明显的经济效应。 3、植物种质资源的保存、挽救濒于灭绝的植物 长期以来人们想了很多方法来保存植物，如储存果实，储存种子，储存块根、块茎、种球、鳞茎；用常温、低温、变温、低氧、充惰性气体等，这些方法在一定程度上收到了好的或比较好的效果，但仍

13、存在许多问题。主要问题是付出的代价高，占的空间大，保存时间短，而且易受环境条件的限制。植物组织培养结合超低温保存技术，可以给植物种质保存带来一次大的飞跃。因为保存一个细胞就相当与保存一粒种子，但所占的空间仅为原来的几万分之一，而且在-193度的液氮中可以长时间保存，不像种子那样需要年年更新或经常更新。 环境的不断变化使许多种类的植物面临着灭绝的危险，而且许多种植物已经灭绝，留给人类的只是一种遗憾。如何挽救这些植物，还有许许多多的动物，已成为世人关注的问题。实践证明，通过组织培养的方法可以使一部分濒危的植物种类得到延续和保存；如果在结合超低温保存技术，就可以使这些植物得到较为永久性的保存。其实，

14、对大多数普通植物来说，用组织培养的方法保存其种质材料，也具有十分重要的意义。因为，人们现在无法预知哪些植物会面临灭顶之灾，或许今天看似繁茂的植物，明天就可能被沙漠、洪水、大火或战争吞没。 4、通过花药和花粉培养获得单倍体植株、缩短育种年限 通过花药和花粉组织培养可以获得单倍体植物，大大缩短了育种时间。使新品种的培育过程大大简化 5、胚胎培养的应用 在远源杂交中，杂交后形成的胚珠往往在未成熟状态时，就停止生长，不能形成有生活力的种子，因而杂交不孕，这给远缘杂交造成极大困难。十九世纪二十年代末，Laibach用胚培养技术培养亚麻种间杂种胚，第一个获得了杂种植物，这一成功为在远缘时克服杂交不亲和的障

15、碍提供了一项有用的技术。 这项技术发展至今，已经相当成熟，可以说多数植物的成熟或未成熟胚通过培养都可获得成功。幼胚培养已经可使5个细胞大小的极幼龄的胚状结构培养成植株。但胚珠培养的研究不多，单个胚珠培养尚存在许多问题，需作深化研究。 远缘杂交中，由于生理上和遗传上的障碍而不能杂交成功，可采用试管受精加以克服，即将母本胚珠离体培养，使异种花粉在胚珠上萌发受精，产生的杂种胚在试管中发育成完整植株。 用胚乳培养可获得三倍体植株，为诱导形成三倍体植物开辟了一条新途径。三倍体加倍后得到六倍体，可育成多倍体品种。 6、细胞融合 通过原生质体融合，可部分克服有性杂交不亲和性，而获得体细胞杂种，从而创造新种或

16、育成优良品种。 7、培养细胞突变体的应用 培养细胞处在不断分生状态，它就容易受培养条件和外加压力（如射线、化学物质）的影响而产生突变，从中可以筛选出有用的突变体，从而育成新品种。目前用这种方法已经筛选到抗病、抗盐、高蛋白、高产等突变体，有些已经用于生产。 8、用于遗传学、分子生物学、细胞生物学、组织学、胚胎学、基因工程、生物工程等地研究 要揭开生命活动的秘密，需要多科学、多技术的相互配合，其中植物组织培养技术是不可缺少的，它为遗传学、分子生物学、细胞生物学、生物工程等提供了一种有效、快速的方法。因为要揭示生命的奥秘，首先要研究单个基因的作用，研究它在细胞内是如何组装的，如何与其它基因发生联系，

17、如何表达和调控等。分离单个基因，对它DNA进行测序，再对其中的某些碱基实行突变，然后还需要将基因送到受体细胞当中，看表达情况，以确定其功能。接受基因的受体细胞要产生再生植株，就需要通过组织培养的方法才能实现。 9、利用组织培养的材料作为植物生物反应器 中国的中草药是一份人类宝贵的财富，但很多种中草药资源匮乏，产量不足，甚至濒于灭绝。如果能利用组织和细胞培养的方法在实验室内生产，不再依附于自然环境，不仅可以解决现有困难，而且可以通过筛选高产有效成分的细胞系，来提高其药用价值。比如用培养的人参悬浮细胞，来生产人参皂苷，已在日本等国家形成规模。利用培养的植物细胞和组织细胞作为生物反应器，也可以生产某

18、些蛋白质、氨基酸、抗生素、疫苗等，如用生食蔬菜生产乙肝疫苗正在实验中。 10、用于其它未知科学的研究 现代科学发展非常迅速，很多现在预想不到的事情都有可能发生，新发明、新发现、新创造层出不穷，今天认为不可能的东西明天就可能变成现实。植物组织培养也同样具有许多尚未发掘出的潜力，说不定有一天人们会在三角瓶内种出大南瓜。 总之，现在的植物组织培养仍然处于发展阶段，远远没有达到它的高峰期，很多机理人们还没有搞清楚，它的潜力还远远没有发挥出来。相信在今后的几十年内，组织培养将会有更大的发展，在农业、制药业、加工业等方面将会发挥更大的作用，创造出更大的经济效益。 编辑本段组织培养的分类按外植体分,植物组织

19、培养可分以下几类:1、胚胎培养植物的胚胎培养，包括胚培养、胚乳培养、胚珠和子房培养，以及离体受精的胚胎培养技术等。 2、器官和组织培养器官培养是指植物某一器官的全部或部分或器官原基的培养，包括茎段、茎尖、块茎、球茎、叶片、花序、花瓣、子房、花药、花托、果实、种子等。组织培养有广义和狭义之分。广义：包括各种类型外植体的培养。狭义：包括形成层组织、分生组织、表皮组织、薄壁组织和各种器官组织，以及其培养产生的愈伤组织。 3、细胞培养细胞培养包括利用生物反应器进行的，旨在促进细胞生长和生物合成的大量培养系统和利用单细胞克隆技术促进细胞生长、分化直至形成完整植株的单细胞培养。 4、原生质体培养植物原生质

20、体是被去掉细胞壁的由质膜包裹的、具有生活力的裸细胞。 编辑本段组织培养的步骤一、培养基配制配制培养基有两种方法可以选择，一是购买培养基中所有化学药品，按照需要自己配制；二是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂，如MS、B5等。 自己配制可以节约费用，但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题，给实验带来麻烦。就目前国内的情况看，大部分还是自己配制。为了方便起见，现以MS培养基为例介绍配置培养基的主要过程。 1、配制几种母液 （1）配制MS大量元素母液 一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。 分别称取 NH4NO3 165g KH2PO4 17g KNO3 190g

21、CaCl2·2H2O 44g MgSO4·7H2O 37g 各自配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。 （2）配制MS微量元素母液 一般将微量元素配制成100倍母液。 依次称取 KI 0.083g Na2MoO4·2H2O 0.025g H3BO3 0.62g CuSO4·5H2O 0.0025g MnSO4·H2O 1.69g CoCl2·6H2O 0.0025g ZnSO4·7H2O 0.86g 配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。 CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于

22、称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。 分别称取 CuSO4·5H2O 0.05g CoCl2·6H2O 0.05g 各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。 （3）配制MS有机母液 一般配制成100倍MS有机母液。 依次称取 肌醇 10g 盐酸硫胺素（VB1） 0.01g 烟酸 0.05g 甘氨酸 0.2g 盐酸吡哆醇（VB6） 0.05g 配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。 （4）配制MS铁盐母液 一般配制成100倍MS铁盐母液。 依次称取 EDTA二钠 3.73g FeSO4·7H2O 2.78g

23、配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。 所以MS母液有5种大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液，共8种母液。 激素母液的配制 各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。一般取100mg配成100ml母液。 2、配制培养基 以配置1L MS培养基为例，按顺序进行如下操作： （1）先在烧杯中放入一些蒸馏水。 （2）分别取上面八种母液10ml倒入。 （3）一般称取30g蔗糖倒入，搅拌溶解。 （4）加蒸馏水用量筒定溶至1L。 （5）按设计好的方案

24、添加各种激素，由于激素的用量很小，而且激素对组培植物的生长至关重要。所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取，减少误差。 （6）用精密试纸或酸度计调整PH至5.7-5.8。（有条件的话使用酸度计，比较精确） 可配1当量的HCL和1当量的NaOH用来调溶液PH值。 1当量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。 1当量NaOH配制：称取NaOH 4g 配成100ml溶液。 （7）称取5g左右琼脂粉（质量好的琼脂粉),倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化。 （8）稍微冷却后，分装入培养容器中。无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮筋或绳子扎紧。 （9）放入消毒

25、灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右。 （10）灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。 二、灭菌灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。依此观点，无菌室等未处理的地方、超净台的表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。 这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点是：极小，肉眼看不见。无处不在，无时不有，无孔不入。在自然条件下忍耐力强，生

26、活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。 无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理或化学的灭菌方法处理后的物体（当然这些方法必须已经证明是有效的），高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部都是无菌的。从以上可以看出：在地球表面无菌世界要比有菌世界小的多。 灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环

27、境里和物品上还有活着的微生物，所以通过严格灭菌的操作空间（接种、超净台等）和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，就叫做无菌操作。 植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的，甚至超过微生物的培养要求，这是因为培养基含有丰富的营养，稍不小心就引起杂菌污染。要达到彻底灭菌的目的，必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌，才能保证培养时不受杂菌的影响，使试管苗能正常生长。 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用

28、升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏水、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。 1、培养基用湿热灭菌 培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.

29、05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。 关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1-0.15MPa，20分钟。 按容器大小不同，保压时间有所不同，见表。该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字，如果容器体积较大，但是放置的数量很少，也可以减少时间。 三、接种接种时由于有一个敞口的过程，所以是极易引起污染的时期，这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起，接种室要严格进行空间消毒。接种室内保持定期用1%-3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行搽洗。除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外，还可在使用期间用70%的酒精或3%的来苏儿喷雾，使空气中灰尘

30、颗粒沉降下来。无菌操作可按以下步骤进行： （1）在接种4小时前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外线灯进行杀菌； （2）在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯； （3）接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等； （4）上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。然后搽拭工作台面； （5）先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干； （6）接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等； （7）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。 接种是将已消毒好的

31、根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放入培养基的过程。现将接种前后的程序连贯地介绍。 无菌接种步骤： （1）将初步洗涤及切割的材料放入烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上。 （2）材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm平方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1-2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。 （3）用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体操作过程（以试管为例）是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管口靠

32、近酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面。然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基上。若是叶片直接附在培养基上，以放1-3块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放（尖端向上）外，其他尚无统一要求。接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒种。并用棉塞，塞好后，包上包口纸，包口纸里面也要过火。 四、培养培养指把培养材料放在培养室（有光照、温度条件）里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。 1、培养方法 （1）固体培养法 即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法。虽然该

33、方法设备简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。 （2）液体培养法 即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少，所以通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50-100r/min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。 2、培养步骤 （1）初代培养 初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。即接种某些外植体后，最初的几代培养。初代培养时，常用诱导或分化培养基，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。初代培养建立的无性繁殖系包括：茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。根

34、据初代培养时发育的方向可分为： 1）顶芽和腋芽的发育 采用外源的细胞分裂素，可促进使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长，从而形成一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。在几个月内可以将这种丛生苗的一个枝条转接继代，重复芽苗增殖的培养，并且迅速获得多数的嫩茎。然后将一部分嫩茎转移到生根培养基上，就能得到可种植到土壤中去的完整小植株。一些木本植物和少数草本植物也可以通过这种方式来进行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。这种繁殖方式也称作微型繁殖，它不经过发生愈伤组织而再生，所以是最能使无性系后代保持原品种的一种繁殖方式。 适宜这种再生繁殖的植物，在采样时，只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段，

35、其他如种子萌发后取枝条也可以。 茎尖培养可看作是这方面较为特殊的一种方式。它采用极其幼嫩的顶芽的茎尖分生组织作为外植体进行接种。在实际操作中，采用包括茎尖分生组织在内的一些组织来培养，这样便保证了操作方便以及容易成活。 用靠培养定芽得到的培养物一般是茎节较长，有直立向上的茎梢，扩繁时主要用切割茎段法，如香石竹、矮牵牛、菊花等。但特殊情况下也会生出不定芽，形成芽丛。 2）不定芽的发育 在培养中由外植体产生不定芽，通常首先要经脱分化过程，形成愈伤组织的细胞。然后，经再分化，即由这些分生组织形成器官原基，它在构成器官的纵轴上表现出单向的极性（这与胚状体不同）。多数情况下它形成芽，后形成根。 另一种方

36、式是从器官中直接产生不定芽，有些植物具有从各个器官上长出不定芽的能力如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。当在试管培养的条件下，培养基中提供了营养，特别是提供了连续不断植物激素的供应，使植物形成不定芽的能力被大大地激发起来。许多种类的外植体表面几乎全部为不定芽所覆盖。在许多常规方法中不能无性繁殖的种类，在试管条件下却能较容易地产生不定芽而再生，如柏科，松科，银杏等一些植物。许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不定芽，用百合鳞片的切块就可大量形成不定鳞茎。 在不定芽培养时，也常用诱导或分化培养基。用靠培养不定芽得到的培养物，一般采用芽丛进行繁殖，如非洲菊、草莓等。 3）体细胞胚状体的发生与发育 体细胞胚状体

37、类似于合子胚但又有所不同，它也通过球形，心形，鱼雷形和子叶形的胚胎发育时期，最终发育成小苗。但它是由体细胞发生的。胚状体可以从愈伤组织表面产生，也可从外植体表面已分化的细胞中产生，或从悬浮培养的细胞中产生。 4）初代培养外植体的褐变 外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接触外植体的培养。 褐变的主要原因如下： a、植物品种 研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差异

38、，因此，有些花卉品种的外植体在接种后较容易褐变，而有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。 b、生理状态由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同。一般说来，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。 c、培养基成分 浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。 d、培养条件不当 如果光照过强

39、、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。 为了提高组织培养的成苗率，必须对外植体的褐变现象加以控制。可以采用以下措施防止、减轻褐变现象的发生。 1、选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。 2、合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。 3、使用抗氧化剂 在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。另外，使用0.1%-0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。 4、连续转移 对容易褐变的材料可间隔2

40、-24小时的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7-10天后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。 (2)继代培养 在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等，数量都还不够，它们需要进一步增殖，使之越来越多，从而发挥快速繁殖的优势。 继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁殖培养过程。旨在繁殖出相当数量的无根苗，最后能达到边繁殖边生根的目的。继代培养的后代是按几何级数增加的过程。如果以2株苗为基础，那么经10代将生成210株苗。 继代培养中扩繁的方法包括：切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等。切割茎段常用于有伸长的茎梢、茎节较明显的培养物。这种方法简便易行，能保持母种特性

41、。培养基常是MS基本培养基；分离芽丛适于由愈伤组织生出的芽丛。培养基常是分化培养基。若芽丛的芽较小。可先切成芽丛小块，放入MS培养基中，待到稍大时，再分离开来继续培养。 增殖使用的培养基对于一种植物来说每次几乎完全相同，由于培养物在接近最良好的环境条件，营养供应和激素调控下，排除了其他生物的竞争，所以能够按几何级数增殖。 在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程，而继代培养则是经常性不停的进行过程。但在达到相当数量之后，则应考虑使其中一部分转入生根阶段。从某种意义上讲，增殖只是储备母株，而生根才是增殖材料的分流，生产出成品。 （3）继代培养时材料的玻璃化 实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时

42、，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水迹状，这种想象通常称为玻璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。玻璃化为试管苗的生理失调症。 因为出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生根，因此，使繁殖系数大为降低。在不同的种类、品种间，试管苗的玻璃化程度也有所差异。当培养基上细胞分裂素水平较高时，也容易出现玻璃化现象。在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质，能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生。 呈现玻璃化的试管苗，其茎、叶表面无蜡质，体内的极性化合物水平较高，细胞持水力差，植株蒸腾作用强，无法进行正常移栽。这种情况主要是由于培养容器中空气湿度过高，透气性较差造成的，其具体解决的方法为： a、增加培

43、养基中的 溶质水平，以降低培养基的水势； b、减少培养基中含氮化合物的用量； c、增加光照 d、增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用； e、降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化现象发生； f、降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。 3、生根培养 当材料增殖到一定数量后，就要使部分培养物分流到生根培养阶段。若不能及时将培养物转到生根培养基上去，就会使久不转移的苗子发黄老化，或因过分拥挤而使无效苗增多造成抛弃浪费。根培养是使无根苗生根的过程，这个过程目的是使生出的不定根浓密而粗壮。生根培养可采用1/2或者1/4MS培养基，全部去掉细胞

44、分裂素，并加入食粮非的生长素（NAA、IBA等）。 诱导生根可以采用下列方法 a、将新梢基部浸入50或100*10-6IBA溶液中处理4-8小时； b、在含有生长素的培养基中培养4-6天 c、直接移入含有生长素的生根培养基中。 上述三种方法均能诱导新梢生根，但前两种方法对新生根的生长发育则更为有利。而第三种对幼根的生长有抑制作用。其原因是当根原始体形成后较高浓度生长素的继续存在，则不利于幼根的生长发育。不过这种方法比较可行。 另外也可采用下列方法就可生根。1、延长在增殖培养基中的培养时间；2、有意降低一些增殖倍率，减少细胞分裂素的用量（即将增殖与生根合并为一步）；3、切割粗壮的嫩枝在营养钵中直

45、接生根，此方法则没有生根阶段。可以省去一次培养基制作，切割下的插穗可用生长素溶液浸蘸处理，但这种方法只适于一些容易生根的作物。 另外少数植物生根比较困难时，则需要在培养基中放置滤纸桥，使其略高于液面，靠滤纸的吸水性供应水和营养，从而诱发生根。 从胚状体发育成的小苗，常常有原先已分化的根，这种根可以不经诱导生根阶段而生长。但因经胚状体发育的苗数特别多，并且个体较小，所以也常需要一个低浓度或没有植物激素的培养基培养的阶段，以便壮苗生根。 试管内生根壮苗的阶段，为了成功地将移植到试管外的环境中，以使试管苗适应外界的环境条件。通常不同植物的适宜驯化温度不同。如菊花，以18-20为宜。实践证明植物生长的

46、温度过高不但会牵涉到蒸腾加强。而且还牵涉到菌类易滋生的问题。温度过低使幼苗生长迟缓，或不易成活。春季低温时苗床可加设电热线，使基质温度略高于气温2-3，这不但有利于生根和促进根系发达，而且有利于提前成活。 移植到试管外的植物苗光强度应比移植前培养有所提高，并可适应强度较高的漫射光，（约4000lx左右），以维持光合作用所需光照强度。但光线过强刺激蒸腾加强，会使水分平衡的矛盾更尖锐。 五、驯化移栽试管苗移栽是组织培养过程的重要环节，这个工作环节做不好，就会造成前功尽弃。为了做好试管苗的移栽，应该选择合适的基质，并配合以相应的管理措施，才能确保整个组织培养工作的顺利完成。 试管苗由于是在无菌、有营

47、养供给、适宜光照和温度近100%的相对湿度环境条件下生长的，因此，在生理、形态等方面都与自然条件生长的小苗有着很大的差异。所以必须通过炼苗，例如通过控水、减肥、增光、降温等措施，使她们逐渐地适应外界环境，从而使生理、形态、组织上发生相应的变化，使之更适合于自然环境，只有这样才能保证试管苗顺利移栽成功。 从叶片上看，试管苗的角质层不发达，叶片通常没有表皮毛，或仅有较少表皮毛，甚至叶片上出现了大量的水孔，而且，气孔的数量、大小也往往超过普通苗。由此可知，试管苗更适合于高湿的环境生长，当将它们移栽到试管外环境时，试管苗失水率会很高，非常容易死亡。因此，为了改善试管苗的上述不良生理、形态特点，则必须经过与外界相适应的驯化处理，通常采取的措施有：对外界要增加湿度、减弱光照；对试管内要通透气体、增施二氧化碳肥料、逐步降低空气湿度等。 另外，对栽培驯化基质要进行灭菌是因为试管苗在无菌的环境中生长，对外界细菌、真菌的抵御能力极差。为了提高其成活率，在培养基质中可掺入75%的百菌清可湿性粉剂200-500倍液，以进行灭菌处理。 1、移栽用基质和容器 适合于栽种试管苗的基质要具备透气性、保湿性和一定的肥力，容易灭菌处理，并不利于杂菌滋生的特点，一般可选用珍珠岩、蛭石、砂子等。为了增加粘着力和一定的肥力可配合草炭土或腐殖土。配时需按比例搭