槲皮素,铜离子对葡萄糖苷酶的抑制作用

1、槲皮素，铜离子对a-葡萄糖苷酶的抑制作用研究一、实验原理a-葡萄糖苷酶(-glucosidase)是一类能够从含有a-葡萄糖苷键底物的非还原端催化水解a-葡萄糖基的酶的总称，包括麦芽糖酶、异麦芽糖酶、蔗糖酶等，又叫a-D-葡萄糖苷水解酶。位于小肠绒毛粘膜细胞刷状缘的a-葡萄糖苷酶在机体的代谢过程中起着十分关键的作用，参与了人体对摄入的淀粉和蔗糖等碳水化合物的消化吸收、糖蛋白和糖脂的加工，与许多因代谢紊乱失调而引起的疾病、神经细胞的分化、肿瘤的转移以及病毒和细菌的感染有密切关系。因此，通过抑制-葡萄糖苷酶的活性可以达到治疗某些疾病的目的，研究最为成熟的是治疗型糖尿病的口服降糖药物。其作用机制为：

2、竞争性抑制位于小肠的各种-葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。虽然苯并咪唑衍生物对-葡萄糖苷酶的抑制活性鲜有报道，但-葡萄糖苷酶抑制剂的种类繁多，如多糖类（包括多糖、纤维素、果胶、寡糖等）、黄酮类、生物碱类、皂苷类等。应用于临床的-葡萄糖苷酶抑制剂主要是：阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇（图1）。当前，为了寻找抑制活性更强、副作用更低以及合成步骤更简单的-葡萄糖苷酶抑制剂，国内外仍不断地致力于开发新型的-葡萄糖苷酶抑制剂。 图1阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇的结构式二、实验材料与方法1. 实验试剂酵母a-葡萄糖苷酶、 对硝基苯酚葡萄糖苷(pNP

3、G)、 金属离子和糖类、 槲皮素 (HPLC分析测试纯的大于98%)、 缓冲溶液0.01M的溶质(磷酸钠盐：pH=6.80) （1）槲皮素溶液的配制：称取3.02mg槲皮素溶解于10ml DMSO中，配成1mol/ml。（2）硫酸铜溶液的配制：称取2.50mg五水硫酸铜溶解于10ml蒸馏水中，配成1mol/ml。（3）a-葡萄糖苷酶溶液的配制：称取2mg酶，溶解在1ml缓冲液中。（4）底物的配制：称取对硝基苯酚葡萄糖糖苷（pNPG）15mg，溶液在15ml蒸馏水中。2. 实验仪器岛津UV-2501PC、 江苏海门市麒麟医用仪器厂QL-901型漩涡混合器、 石英比色皿(光径1cm)、可调试移液器

4、、 瑞士Gunt W28恒温水浴锅、 CvberScan pH510型电子数显pH计。3. 实验方法（1）a-葡萄糖苷酶抑制活性的半抑制浓度IC50测定方法在1.5mL的离心管中加入50l一定浓度的样品溶液（DMSO溶解）、10l a-葡萄糖苷酶溶液（1.00mg/mL），磷酸盐缓冲液（0.01mol/L, pH=6.80）880l，在室温下放置20min后，加入60l 对硝基苯酚葡萄糖糖苷（pNPG）溶液（1.00mg/mL），迅速混合均匀后测定其在400 nm处吸光度的时间扫描曲线，由其随时间增长而上升的斜率可反映其反应速率。以相同体积的空白DMSO的反应速率为控制速率K0。不同浓度槲皮素

5、样品的配制：样品溶液 （l）： 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0（空白）DMSO （l）： 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50与缓冲液、酶液培育20分钟，加底物60l，混合后400nm测光吸收随时间变化值。不同浓度铜离子样品配制：样品溶液（l）： 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0（空白）缓冲液 （l）： 880 885 890 895 900 905 910 915 920 925 930加入酶液10l）后，培育20分钟，加底物60l，混合后400nm测光吸收随时间变化值。（2）a-葡萄糖苷酶抑制作用类型动力学的

6、测试方法采用Lineweaver-Burk作图法判断。反应速率的测量方法同上。固定酶和样品浓度，改变底物浓度，得一系列反应速率值，以1/V对1/S作图，即得一条双倒数曲线。保持酶浓度不变，改变样品浓度，以同样方法得到另外几条双倒数曲线。根据双倒数作图可确定其为可逆抑制类型，根据双倒数方程可计算a-葡萄糖苷酶的米氏常数Km和样品对a-葡萄糖苷酶抑制作用的抑制常数Ki。底物浓度的变化：20l，25l，30l，35l，40l，45l，50l，55l，60l。建议铜离子浓度：样品固定10l，20l。建议槲皮素浓度：10l，20l三、数据处理（1）作图法求IC50值根据实验结果，将没有加入样品时的酶活力

7、定为100%，那么加入不同浓度样品后的酶活力为相对活力百分数(即残余活力百分数)表1 槲皮素抑制活性结果槲皮素体积/L50454035302520151050槲皮素浓度/mol/L50454035302520151050OD4000.0150.0160.0160.0180.0040.0250.0260.0300.0260.0410.050a/%3032323685052605282100将相对活力与样品浓度（mol/L）作图，从图上找出酶相对活力为50%时，样品的浓度，即为IC50值。去除2个（3号、7号）误差大的数据后作图得：图2 槲皮素抑制相对活力a-浓度c作图从图中可以看出，相对活力为5

8、0%时槲皮素浓度大约为23mol/L，即为IC50值。（2）抑制作用动力学实验作图表2 抑制作用动力学实验结果底物体积/L202530354045505560底物浓度mol/L65.281.597.8114.1130.4146.7163179.3195.5底物浓度倒数/（mol/L）-10.01530.01230.01020.008760.007670.006820.006130.005580.00512槲皮素20LOD4000.0050.0150.0160.0160.0200.0170.0250.0270.034OD400/min取倒数20066.762.562.550.058.840.03

9、7.029.4槲皮素10LOD4000.0140.0130.0160.0240.0190.0290.0280.0140.036OD400/min取倒数71.476.962.541.752.634.535.771.427.8槲皮素0LOD4000.0330.0370.0380.0390.0560.0590.0610.0630.056OD400/min取倒数30.327.026.325.617.816.916.415.917.8作图如下：图3 未加槲皮素时1/V-1/S模拟图由图中数据可得模拟方程为：1/V(min)=1531.1/S （mol/L）-1+8.31图4 槲皮素体积为10L时1/V-

10、1/S模拟图由图中数据可得模拟方程为：1/V(min)=4860.5/S （mol/L）-1+5.46图5 槲皮素体积为20L时1/V-1/S模拟图由图中数据可得模拟方程为：1/V(min)=6439.4/S （mol/L）-1+2.35米氏常数推导如下：由上图可知：未加槲皮素时Km=1531.1/8.31=184.2 mol/L槲皮素体积为10L时Km=4860.5/5.46=890.2 mol/L槲皮素体积为20L时Km=6439.4/2.35=2740.2 mol/L平均值Km=（184.2+890.2+2740.2）/3=1271.5 mol/L讨论本实验测定IC50值时，在去除两个异常值后得到的曲线拟合得较好，说明实验结果较准确。测定槲皮素对a-葡萄糖苷酶的抑制动力学类型时得到的数据误差较大，以此计算的Km值波动也大，这与Km值只与酶的种类有关，与酶浓度和底物浓度均无关的事实不相符合，其中误差主要与取样时的体积误差、紫外仪的灵敏度限制和样品的浓度误差有关。四、结论 本实验研究了槲皮素对a-葡萄糖苷酶的抑制作用，测定了其抑制活性IC50值，还研究了槲皮素对a-葡萄糖苷酶