表皮生长因子对大鼠肺表面活性物质合成的调控及机制

1、    表皮生长因子对大鼠肺表面活性 物质合成的调控及机制         摘要 目的和方法：采用无血清成年大鼠肺组织培养，用液体闪烁计数器测 定3H-胆碱掺入磷脂酰胆碱量，消化定磷法测总磷脂，薄层层析及薄层扫描测磷脂各组 分含量变化，观察生理浓度表皮生长因子对成年大鼠肺表面活性物质合成的调控。 结果：10-9 mol/L EGF作用8 h后，PC合成量显著增加，16 h达高峰； E GF可显著增加总磷脂、PS特征性成分PC、PG合成(P<0.01)。而细胞膜

2、特征性组分PE、PS e、SM、PI均无显著影响（P>0.05)；PTK抑制剂Tyrphostin 47、PKC抑制剂H7均对E GF促PS合成有阻断效应。EGF、TP47、H7对肺组织LDH释放量无显著影响。结论 ：EGF参与生理状态下成年大鼠PS合成的调控，其信号转导与EGF受体PTK和细胞内PK C途径有关。关键词：表皮生长因子；肺表面活性物质；酪氨酸蛋白激酶 ；蛋白激酶C中分类号：R332.2；Q47文献标识码：A文章编号： 1000-6834(2000)04-0335-04MODULATION OF EPIDERMAL GROWTH FACTOR ONTHE SYNTHESIS

3、 OF PULMONARY SURFACTANTAND ITS MECHANISMLI Jian-hua（Department of physiology Guangzhou medical college Guangzhou 510182）SUN Xiu-hong（Department of physiology Hunan medical university, ChangSha 410078）LUO Zi-qiang（Department of physiology Hunan medical university, ChangSha 410078）ABSTRACTAim: To stu

4、dy the effect of EGF at physiological level on PS synthes is o n cultured lung explants without serum. Methods: The total phosp holipids and major phospholipid components in lung tissues were determined. The amount of 3H-choline incorporation into PC was measured.R esults:10-9 mol/L EGF enhanced 3H-

5、choline incorpo ration into PC at 8 h and reached the maxiumum at 16 h.The synthesis of total phospholipids, PC and PG increased from lung tissues exposed to 10-9 mol /L EGF, but membrane characteristic phospholipid showed no change.TP 47,a PTK inhibitor and H7, a PKC inhibitor could block EGF- indu

6、ced PS synthesis.The release of LDH from lung explants could not be changed by EGF, TP 47 and H7. WTHZConclusion: EGF at physiological level could enhance the adult rat PS synthesis, and its modulated mechanisms involved PTK and PKC pathways.KEY WORDS:epidermal growth factor;pulmonary surfacta nt;pr

7、otein tyrosine kinase;protein kinase C表皮生长因子(EGF)是1962年由Cohen等人首次从小鼠颌下腺中分离纯化出来的，存在于绝大 部分组织及几乎所有的体液中，肺脏是EGF含量较为丰富的器官之一。对EGF肺内生物学效应 的研究过去一直集中在促丝裂作用，发现EGF可促进肺成纤维细胞、气道上皮细胞和平滑肌 细胞、肺泡型细胞等肺内多种细胞的DNA合成1，2。我室报道3，4 EGF可抑制肺泡巨噬细胞迁移，对臭氧所致的气道上皮细胞损伤具有保护作用，这启迪我们 从非 促丝裂作用方面去研究EGF及其受体在肺内广泛分布的生物学意义。成年大鼠肺泡细胞能 够合成EGF、表达

8、EGF受体，外源性EGF促进磷脂酰胆碱(PC)分泌，提示EGF以自分泌方式调控 肺泡型细胞生理功能5。已有研究显示，促分泌的物质大都具有促合成作用， 而生理浓度EGF对成年大鼠肺表面活性物质(PS)合成有何影响尚未见报道。本研究在无血清 培养的肺组织块上观察生理浓度EGF对PS合成的作用，旨在进一步证实EGF作为生理性调节因 子参与肺泡型细胞生理功能的调控。1材料与方法1.1材料EGF(Wakunage pharmaceutical(Co),H7、Tyrphostin 47(TP 47)、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘 油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、鞘磷脂(SM)、磷脂酰丝氨酸(PSe)、磷脂酰乙醇胺

9、(PE)(Sigma), 3H-氯化胆碱(英国杜邦公司)，乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(北京中生公司)，薄层层析板(20 ×20cm青岛海洋化工)，其它试剂均为国产分析纯级。1.2实验方法6氨基甲酸乙脂(g/L)麻醉大 鼠，开胸暴露心肺，肺动脉插管，用生理盐水冲洗肺血。分离双肺，剪成1 mm3小块，预 冷DMEM洗3次，取2030小块肺组织置于直径为30 mm培养皿中，加入不含血清的DMEM 1 ml( 含青霉素100 g/ml、链霉素100 g/ml)，置95%O2、5%CO23H-胆碱掺入PC量检测对照组与各处理组加入3H-氯化胆碱 (0.2 Ci/ml)，培养 4 h、8 h、1

10、6 h、24 h后，收集肺组织，洗涤3次制成10%的匀浆。L owry法测定蛋白质含量，用氯仿：甲醇(21 vol/vol)萃取总脂质2遍，氮气吹干，200 l 氯仿重新溶解，液体闪烁计数测33H-氯 化胆碱培养16 h，收集肺组织，制成肺匀浆，按上法萃取总脂质，分成两等份。一份用高氯 酸：浓硫酸消化后，抗坏血酸-钼酸胺显色，于700 nm比色定磷，按磷脂中平均4%有机磷换 算成总磷脂含量。另一等份按Korte71.3统计学分析2结果2.1EGF对肺组织PS合成的影响3H-胆碱掺入量影响的时效关系10-9mol/L EGF作 用424 h,8 h时EGF组肺组织3H-胆碱掺入量显著增加，16

11、h时达高峰，但作用时间少于 8 h，两组3H-胆碱掺入量无显著差异(P>0.05，表1)。Tab.1 Effect of EGF on 3GronpCulture time(h)481624Control35.4±11.360.7±6.091.8±10.8115.5±14.1EGF37.1±7.269.4±7.2*115.6±10.2*138.3±5 .6*EGF/Control1.051.141.261.20     *P<0.05,?*P<0.01,vs

12、 co ntrol -9mol/L EGF作用16 h ，使肺组织总磷脂合成增加1.27倍，PC增加1.41倍，PG增加1.90倍(P<0.01)， 而不影响其它磷脂组分如SM、PI、PSe、PE的含量(P>0.05,表2)GronpPhospholipidsPCPGSMPI+PSePETotal phospholipidControl110.9±18.05.8±0.666.1±10.237.9±9.878.6±17.83 14.4±50.0EGF156.3±18.3*10.0±2.2*67.6

13、7;5.541.6±10.285.6±18.3400.1±51.3*EGF/Control1.411.901.091.101.021.2 7     Incubated time 16 h. *P<0.01,vs control 2.2酪氨酸蛋白激酶(PTK)抑制剂的影响EGF受体PTK特异性抑制剂TP 47(10-5mol/L)可阻断EGF的促3H-胆碱掺入效应。( P<0.01，1)。         Fig.1 Effect o

14、f TP 47 on EGF induced 3H-chol ine incorporation into PC.Incubated time 16 h.*P< 0.01,vs control; #P<0.01, vs EGF2.3PKC在EGF促PS合成中的作用PKC抑制剂H7(10-5mol/L)可使肺组织3H-胆碱掺入量降至对照水平(P<0.05, 2)。         Fig.2 Effect of H7 on EGF induced 3H -choline incorporation

15、into PC.Incubated time 16 h.?* P<0.01,vs control; #P<0.01, vs EGF2.4对肺组织LDH释放量的影响对照组、EGF组、EGF+TP 47组及EGF+H7组各组间LDH释放量无显著差异(P>0.05)，说 明本实验采用的培养体系及培养条件不会造成肺组织损伤(表3)。Tab.3 Effect of EGF,TP 47 and H7GroupLDH releaseControl0.47±0.08EGF0.45±0.05EGF+TP 470.47±0.10EGF+H70.44±0.0

16、7     Incubation time 16 h 3讨论肺内EGF主要以自分泌、旁分泌方式发挥作用，提示肺组织局部EGF浓度应高于血浆水平。正 常人血浆EGF浓度为0.330.67×10-9mol/L，本实验选用的EGF浓度为10-9 mol/L,模拟了肺组织局部生理浓度。肺表面活性物质是肺内特有的生物活性物质，由肺泡 型细胞合成与分泌，磷脂是其主要成分。研究显示，PS磷脂中最具特征性成分是PC、PG，而 PSe、PI、SM、PE是细胞膜结构的特征性成分。我们采用消化定磷法和薄层层析分离肺组织 各磷脂组分，发现肺组织培养16 h后，10-9

17、mol/L EGF使总磷脂及PC、PG分别增加1. 27、1.41、1.90倍，而不影响其它磷脂组分的合成。首次证实EGF作为生理性调节因子促 成年大鼠PS合成。胚胎肺研究显示，EGF促PS合成时间早于促丝裂作用。对成年动物肺细胞的研究表明，EGF持 续存在2224 h以上才能发挥其促丝裂作用1，2。我们观察到EGF作用8 h即可显 著促PS合成，16 h达高峰，表明EGF促PS合成并非由细胞增殖引起，而是一种非促丝裂效应 。EGF与细胞膜上受体结合发挥其生物学效应。EGF与受体结合后，诱导受体膜外区构象改变， 形成活化的受体二聚体，并使细胞内区的PTK激活。TP是一类特异性EGF受体PTK抑

18、制剂，与 底物竞争PTK活化区的结合位点，从而抑制EGF受体酪氨酸残基磷酸化。Chess等8 报道，TP 47可取消转化生长因子-的促型细胞增殖作用。Borok等9观察到 ，EGF能增强型细胞膜上Na+-K+ATP酶活性，促进肺泡液中Na+主动转运，TP 47 能 抑制该反应。提示PTK激活是EGF调控型细胞生理功能的重要环节。本实验观察到TP 47可 有效阻断EGF促PS合成，表明PTK参与介导EGF促PS合成。EGF受体PTK介导的细胞内信号转导通路之一是激活PKC。PKC是一类依赖于Ca2+、甘油 二酯或磷脂酰丝氨酸刺激而激活的、催化蛋白质内丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化反应的蛋白激 酶 型细

19、胞内存在PKC，PS分泌与PKC有关。我们采用PKC抑制剂H7可阻断EGF促PS合成，证实 PKC在EGF调控PS合成过程中起重要作用。通过探讨生理浓度EGF对PS合成的调控及其作用机制，有助于更好地揭示EGF及受体肺内广泛 分布的生物学意义，为进一步阐明肺内微环境自稳态的调控机制提供理论依据。基金项目：湖南省中青年科技基金资助项目(99JZY2076)作者简介：李建华(19-)，女，湖南省人，讲师，医学硕士，主要从事肺 的非呼吸功能方面的研究。李建华（广州医学院生理学教研室，广州510182）孙秀鸿（湖南医科大学生理学教 研室，长沙410078）罗自强（湖南医科大学生理学教 研室，长沙410

20、078）4参考文献1 Frankslon C, Bourbon J R. Comparison of effects of epidermal growth factor and insulin-like growth factor, gastrin releasing peptide and retinoic acid on fetal lung cell growth and maturation in vitroJ.Biochem Biophys Acta,1992,1123:65-75.2 Cerutis D R, Nogami M, Arderson J L, et al. Lyos

21、phosphatidic acid and epidermal growth factors stimulate mitogensis in human airway smooth cellsJ . Am J Physiol, 1997,273:L10-15.3 管茶香，孙秀泓，罗自强，等.表皮生长因子对肺泡巨噬细胞趋化性的调控J. 中国应用生理学杂志，1998，14：11-15.4 秦晓群，孙秀泓，罗自强，等.表皮生长因子对培养的气道上皮细胞抗臭氧的保护作 用J.生理学报，1996，48：190-194.5 Raaberg L, Nex E, Buckey S, et al. Epidermal growth factor transcri ption, translation, and signal transduction by type II pneumocytes in cultur