表面活性剂作为谷氨酸发酵促进剂的研究

1、第25卷第9期2008年9月精细化工Vol.25,No.9Sept.2008FINECHEMICALS食品与饲料用化学品表面活性剂作为谷氨酸发酵促进剂的研究郑成,卫云路,宁正祥,孙保兴生物化工有限公司,广东广州511430)12233(1.广州大学化学化工学院,广东广州510006;2.华南理工大学轻工与食品学院,广东广州510640;3.广州市慧源绿色摘要:通过对预先选择的7种表面活性剂作为谷氨酸发酵促进剂效果的初步筛选,得知两性甜菜碱449和芹菜素硬脂酸酯对产酸率提高有较为明显的效果;进而从加入时间、加入剂量两个方面考察了筛选出的两种表面活性剂对谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriu

2、mglutamicum)T-613菌体生长和谷氨酸发酵产酸的影响,考察了两种表面活性剂同时加入的协同效果,得到了最佳发酵工艺参数。研究结果表明,菌种对数生长期(第3h)加入质量分数为10%的两性甜菜碱449型表面活性剂215mL,发酵中后期(第12h)加入质量分数为015%酸酯018mL,在不影响菌种生长的前提下,促使谷氨酸产酸率由3131,23128%,发酵周期由44h下降为36h,缩短了8h。关键词:表面活性剂;谷氨酸;谷氨酸棒状杆菌T-;中图分类号:TQ423199文献标识码:-(-07tontheGlutamicAcidFermentationZHENGCheng,WEIYun2lu,

3、NINGZheng2xiang,SUNBao2xing1223(1.SchoolofChemicalEngineering,GuangzhouUniversity,Guangzhou510006,Guangdong,China;2.SchoolofLightIndustryandFoodSciences,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510640,Guangdong,China;3.HuiyuanGreenBiological&ChemicalsCompany,Guangzhou511430,Guangdong,China)Abst

4、ract:Comparingtheeffectof7pre2selectedsurfactantsonglutamicacidfermentation,theresultsindicatedthatAmphiproticbetaine449(AB449)andPelargidenon1449stearate(PGS)canrisetherateoftheglutamicacidproduction(RG)obviously.ThentheeffectofthesetwosurfactantsoncellgrowthandglutamateacidproductionbyCorynebacter

5、iumglutamicumT-613wasinvestigatedinrespectofadditiontimeandadditiondosage.Theoptimaltechnologicalparameterswereobtainedbythecooperationeffectofaddingbothsurfactants.Experimentalresultsshowedthatadding10%AB449215mLin3hatthestraingrowthlogarithmicphaseand015%PGS018mLin12hsincethebeginningofthefermenta

6、tion,undertheconditionofstraingrowingnormally,theproductyieldrosefrom3105%to3176%,andtheproductiveefficiencywasraisedbydecreasingthefermentationperiodfrom44hto36h.Keywords:surfactants;glutamicacid;CorynebacteriumglutamicumT-613;fermentationaccelerator;foodadditivesFoundationitem:SupportedbytheGuangd

7、ongprovince(2007B010600062)science&technologyprograms据中国发酵工业协会的资料显示,2006年我国味精总产量达到170多万t,居世界首位,占世界味3收稿日期:2008-03-18;定用日期:2008-04-25基金项目:广东省科技计划项目(2007B010600062)作者简介:郑成(1955-),男,广东省遂溪县人,教授,博士生导师,工学博士,主要研究方向:精细化工产品基础研究与应用开发,电话E-mail:zhcheng123。© 1994-2010 China Academic Journal

8、 Electronic Publishing House. All rights reserved. 第9期郑成,等:表面活性剂作为谷氨酸发酵促进剂的研究881精总产量的一半。味精生产企业正向大型化、集约化发展,生产水平不断提高,但是与一些西方国家比较,我国的生产效率还有待进一步提高,生产成本也急需进一步降低,因此,提高谷氨酸发酵产酸率是一个亟待解决的问题。表面活性剂作为工业“味精”,随着科技的不断1发展,产品种类与产量也与日俱增。国内外研究表明,将表面活性剂作为发酵促进剂的研究越来越28多,主要应用在以发酵法生产酶制剂、氨基91016酸、新型材料等工业领域。目前由于微生物物质代谢和表面活性剂

9、性质的基础研究欠缺,对于表面活性剂作为发酵促进剂的机理还没有定论,近期国外从基因层面对该机理解释取得突破性进1720展。但在上述研究中所使用的表面活性剂均属于传统表面活性剂,至今没有看到较为新型的表面活性剂应用于发酵领域。大多数专家认为,由于表面活性剂独特的结构特征,负反馈作用,提高产率的目的,为了使谷氨酸产率进一步提高,作者选择了7种新型表面活性剂与传统表面活性剂作为谷氨酸发酵促进剂,在摇瓶作为发酵设备的条件下,比较了这7种表面活性剂对细菌生长及细胞外谷氨酸累积的影响,为表面活性剂作为发酵促进剂的原理研究,提供了有效的数据支持。11113培养基及培养条件斜面培养基(质量分数/%):蛋白胨11

10、0,牛肉膏110,氯化钠015,琼脂210;pH=710;32恒温培养1216h,保存于4冰箱待用。种子培养基(质量分数/%):葡萄糖310,玉米浆110,尿素015(单独灭菌),磷酸氢二钾011,七水硫酸镁0104;七水硫酸亚铁2×10,一水硫酸锰2-6×10,pH=710;从斜面接一环菌至种子培养基,250mL摇瓶装液20mL,摇床转速96r/min,温度33,培养时间1214h。发酵培养基(质量分数/%):葡萄糖1310,玉米浆016,初始尿素016(单独灭菌),三水磷酸氢二钠017,七水硫酸镁0106,氯化钾0105,七水硫酸亚铁2-6×10,一水硫酸锰2

11、×10,pH=710,总计尿素312(单独灭菌);按5%,in,-6-6:将SDS、Tween-60、AB449均配制为质量分数1010%的水溶液待用;将PGS、32RdienQ均配制为质量分数015%的水溶液待用。112分析方法谷氨酸含量检测:茚三酮比色法测定。菌种生长量检测:将发酵液稀释10倍,用分光光度计在650nm处测定吸光度OD650值。残糖量检测:用费林试剂法测定。pH检测:用精密pH试纸310514与614810测定。211实验部分111材料及仪器111.1菌株2结果与讨论211菌种基本特性的分析谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)T-6

12、13,广州市微生物研究所保存菌种。11112试剂及仪器十二烷基硫酸钠(SDS)、吐温60(Tween-60)均为市售AR;芹菜素硬脂酸酯(PGS),溴化五甲基二乙撑基三硬脂基三铵(32RdienQ)为本实验室合成;两性甜菜碱表面活性剂(AB001、AB024、AB449)为广州慧源绿色生物化工有限公司提供(编号为企业产品代号)。可见分光光度计(Spectrumlab22PC),上海棱光技术有限公司;生化培养箱(DGG-9070B型),上海森信实验仪器有限公司;新型恒温振荡器(ZHWY-21020C),上海智城分析仪器制造有限公司;超净化工作台(ZHJY-1214B),上海智城分析仪器制造有限公

13、司。冻干菌种经活化培养后,筛选产酸率高且产酸比较稳定的菌株,接保藏斜面于4冰箱中保存备用。为更好地确定加入表面活性剂的时间和剂量,考察了菌种的基本发酵特性如图1、2所示。由图1可知,随着发酵时间的推移,由于菌种对尿素的利用和谷氨酸的产生,使发酵体系的pH下降,当pH下降到7100以下时,应及时向体系中补充一定量的尿素,一方面为菌种生长与产酸提供所必需的氮源,另+一方面尿素被菌种利用时所产生的NH4可以使发酵体系的pH回升,从图中可以看出,此过程较为平缓,不会有pH的突变,有利于提高菌种对加入尿素后新体系的适应性。从残糖量曲线可以看出,发酵初期糖耗量较低,进入对数生长期后,残糖量陡然下降,当进入

14、产酸末期后,菌种的耗糖量进一步下降。© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 882精细化工FINECHEMICALS第25卷因此适应期比较短;对数生长期在1020h;稳定期为2040h;产酸期为1648h。在没有添加表面活性剂条件下,菌种产酸率基本稳定在310%左右。本研究选用菌种的产酸率较目前生产菌种的产酸率相差较大,是因为本文属于基础研究范畴,实验选用发酵法生产谷氨酸的原始菌种,此菌种是从土壤中直接分离纯化而得,并未进行定向诱变育种。另外,取得高产菌种

15、实属不易,对于企业而言,生产菌种为技术核心,具有高度机密性,索取此类高产生产菌种不易;对于拥有高产菌种的高校和研究机构,其研究成果有较高的经济价值,亦不轻易外传。但是基础研究表明,生产谷氨酸的菌种都属于细菌,细胞结构和代谢循环基本一致,产酸机理也大体相同,因此,可以认为在选用原始菌种的发酵体系中,根据产酸率所,2作者选用了SDS、Tween-60、AB001、AB024、AB449、PGS、32RdienQ7种表面活性剂。由于它们性质各异,对微生物毒性也不同,因此添加剂量与加入时间亦存在差异。一般阳离子表面表面活性剂对微生物毒性较大;非离子表面活性剂毒性较小;阴离子表面22活性剂的毒性和杀菌力

16、介于两者之间。将7种表面活性剂分别在发酵开始后第4h和第16h以不同剂量加入,考察它们对发酵产酸率的影响,见表1。可以看出,本文所用菌种的适应期一般为23h,由于种子培养基、发酵培养基成分基本相同,表17种表面活性剂对谷氨酸棒状杆菌产谷氨酸率(%)的影响Table1Effectof7surfactantsontherateofglutamatebyCorynebacteriumglutamicumT-613(%)(Surfactants)/%4h0.010.100.501.005.0016h0.010.100.501.005.00SurfactantsSDS1.750.380.06-1.940

17、.720.840.350.12Tween-602.983.123.052.722.322.823.072.972.872.2632RdienQ1.850.22-3.282.860.890.26-AB0012.651.260.70-2.731.640.840.14-AB0242.922.963.172.772.032.983.043.082.812.63AB4492.973.163.283.522.852.873.043.002.972.68PGS2.842.542.011.821.223.483.053.052.862.46结果表明,除SDS、AB001外,其他5种表面活性剂在特定的加入剂量和

18、加入时间,均使菌种产酸率有一定程度的提高。这可能是因为SDS所带负电抑制了谷氨酸的分泌;AB001杀菌能力较强,菌种对其较为敏感。对于毒性较大的阳离子表面活性剂32RdienQ加量要少,且加入时间应在产酸期,否则会抑制产酸;对于毒性较小的非离子和两性表面活性剂加入剂量在体积分数为011%110%较为有效,加入时间在菌种对数生长期较为有效;非离子表面活性剂PGS情况特殊,菌种对其比较敏感,加入© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 第9期郑成,等:表面活性剂

19、作为谷氨酸发酵促进剂的研究883剂量要控制在体积分数为0101%011%,加入时间在产酸期为宜。综合比较认为:AB449和PGS的效果最好,可将产酸率分别提高19173%和18137%。213两性449、芹菜素硬脂酸酯最佳添加量的确定在发酵培养基中分别加入不同质量分数的AB449、PGS,AB449加入时间为第4h,PGS加入时间为第16h,测定各样品的产酸率和OD650值。结果如图3、4所示。后,对菌种生长有一定的抑制作用,特别是当PGS添加体积分数超过01030%后,对菌种生长有较为严重的负面影响,体现了PGS的杀菌效力。214不同时间加入两种表面活性剂对产酸率的影响因为表面活性剂具有改变

20、细胞膜通透性和杀菌双重作用,不同的加入时间直接影响细菌的生长代谢。因此,寻找最佳的加入时间对发酵产酸具有重要意义,结果如图5、6所示。实验中表面活性剂的添加量为上述实验所得到的最佳剂量,即(AB449)=1125%,(PGS)=01020%。图3Fig.3Effectofonofonthefermentation图3表明,当加入AB449表面活性剂的体积分数在0150%1175%时,谷氨酸发酵的产酸率均较空白实验有一定程度的提高,其中,当加入体积分数为1125%时,谷氨酸的产率达最大值3162%,比对照实验产率提高了18169%;从最终OD650曲线可以看出,加入AB449后对菌种生长有一定的

21、促进作用,没有对菌种生长带来负面影响。图4不同体积分数PGS对谷氨酸发酵的影响Fig.4EffectofvolumefractionofPGSonthefermentation从图5可知,AB449表面活性剂在发酵菌种的对数生长期加入对发酵产酸率有一定的促进作用,特别是在发酵1153h加入,产酸率达到了最大值3186%,较空白实验的产酸率提高了2013%。从最终OD650值曲线也可看出,在菌种对数生长期内添加AB449对菌种生长没有抑制作用。从图6可知,将PGS在发酵菌种的对数生长期加入或在产酸期后期,即20h以后加入对发酵产酸率有一定抑制作用,特别是在发酵前期010h加入,产酸率明显降低,菌

22、种的OD650值也异常低下,分析原因主要是由于菌种对PGS敏感,特别是在菌种图4表明,当加入PGS的体积分数在01005%01020%,谷氨酸发酵的产酸率均较空白实验有一定程度的提高,当PGS加入体积分数达到01020%时,谷氨酸的产率达最大值3164%,比对照实验产率提高了16167%;最终OD650曲线表明,加入PGS© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 884精细化工FINECHEMICALS第25卷快速繁殖生长阶段,细胞膜结构还比较松散,不利于菌

23、种的生长,另外,初期菌种数量有限,PGS的杀菌作用体现比较明显。当将其在对数生长期末期或产酸初期即1216h加入,产酸率则有一定程度提高,在第12h加入时,产酸率达最大值3179%,较空白实验的产酸率提高了1915%。215所选两种表面活性剂协同使用对产酸率的影响由于AB449与PGS各有利弊,前者可以较大程度提高产酸率,但是发酵周期相对较长;后者对于菌种的生长有一定程度的影响,并且产酸率提高的程度不是很大,但是它可以缩短发酵的周期;因此,考虑将两种表面活性剂协同使用,发挥各自的优势,弥补对方的不足。为了得到两种表面活性剂的协同效果,设计正4交实验表L9(3)对两种表面活性剂加入时间、加入剂量

24、进行考察,因素水平如表2所示,正交实验计算结果如表3所示。表2Table2PlaneoffactFactA:volumefractionofAB449/%B:volumefractionofPGS/%C:AdditivetimeofAB449/hD:AdditivetimeofPGS/h>KB2>KB1,C因素的3个水平的优劣顺序为KC2>KC3>KC1,D因素的3个水平的优劣顺序为KD1>KD2>KD3;由极差R可知所设置的因素中RB>RD>RA>RC,即PGS的浓度变化对发酵产酸率影响最大,PGS的加入时间、AB449的浓度影响次之,A

25、B449加入时间影响最小。至此得到了此正交实验的最优组合:A3B3C2D1,即两种表面活性剂协同作用的最佳工艺流程为将AB449在开始发酵后3h加入,添加体积分数为1125%;PGS在开始发酵后12h加入,添加体积分数为01020%。为验证上述正交实验得到的最佳工艺条件,按照优化的工艺参数进行新一批发酵,设置空白实验与之比较,实验结果如图7所示。101750101021221311250101501020314416图7两种表面活性剂协同使用对谷氨酸发酵的影响Fig.7Effectofaddingbothsurfactantsonthefermentation从产酸率曲线可以看出,在加入两种表

26、面活性表3协同作用正交实验方案与结果分析Table3SchemeandresultofcooperationactionorthogonaltestPointsofexperiment123456789K1K2K3K1K2K3R剂之后,菌种产酸的初始时间提前了4h,并且产酸RG/%314031423150313831563153314231473166FactorsABCD的速率也较空白实验有所提高。当空白实验在发酵44h后,达到产酸率最大值3105%,而发酵36h后加表面活性剂的体系产酸率即达最大值3176%,残糖质量分数也下降到了110%以下,其产酸率提高了23128%;产酸率达到最大值后

27、继续发酵,则产酸率有所下降,主要是因为菌种对谷氨酸有一定的利用能力。从最终OD650值曲线可知,在3h和12h加入表面活性剂后,菌种生长受到一定影响,经过4h左右菌种可以较好地适应新的生长环境,并且不会影响产酸率。216表面活性剂加入对发酵周期的影响加入两种表面活性剂后,细胞膜中脂肪酸的比例发生了变化,使菌体细胞膜的通透性增大,更有利于谷氨酸向细胞外分泌,从而减小了产物对于菌体代谢的负反馈作用,提高了谷氨酸的转化效率,缩短了发酵周期,提高了生产效率。从图8可知,在加入PGS或者两种表面活性剂均加入的发酵条件下,谷氨酸达到产酸最大值的时111222333101351014710155314503

28、14903151701067123123123101201014810169314003149331563011631232313121014010149101483146731497314930103012331223110162101401013531540314673145001090从表3可知,A因素的3个水平的优劣顺序为KA3>KA2>KA1,B因素的3个水平的优劣顺序为KB3© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 第9期郑成,等:表

29、面活性剂作为谷氨酸发酵促进剂的研究885间较空白实验分别提前了4h和8h,即发酵周期从原来的44h缩短为40h和36h;在加入AB449后其发酵周期并没有缩短,和空白实验基本保持一致。因此,在两种表面活性剂联合使用时,可以缩短发酵周期,降低发酵的能量消耗,很大程度上提高了生产效率,降低了生产成本。产高温蛋白酶的影响J.微生物学杂志,2004,24(6):58-61.5孙娜亚,姜岷,荀志金.促进剂对BacillussubtilisNX-21合成2谷氨酰转肽酶的影响J.氨基酸和生物资源,2007,29(3):22-25.6EbuneA,AshehS,DuvnjakZ.Effectsofphosph

30、ate,surfactantsandglucoseonphytaseproductionandhydrolysisofphyticacidincanolamealbyAspergillusficuumduringsolid2statefermentationJ.BioresourceTechnology,1995,54(3):241-247.7RamaMohanReddy,GopalReddyP,SeenayyaG.Enhancedproductionofthermostable2amylaseandpullulanaseinthepresenceofsurfactantsbyClostrid

31、iumthermosulfurogenesSV2J.ProcessBiochenmisrtry,1999,34:87-92.8Raziye;ztürk,NurdanKa ikara.ProductionandstimulationofmanganeseperoxidasebyimmobilizedPhanerochaetechrysosporiumJ.ProcessBiochenmistry,2005,40(1):83-87.9DuperrayF,JezequelD,GhaziA,etal.ExcretionofglutamatefromCorynebacteriumglutamic

32、umtriggeredbysurfactantsJ.BmBiophysActa图8不同方式加入表面活性剂对谷氨酸发酵周期的影响Fig.8Effectofmethodofaddingsurfactantsonferperiod10温,陈等J,25(9):1089-1094.,等.添加表面活性剂对2熊果苷发酵的影响J.化工学报,2007,158(9):2352-2355.12张宁,傅亮,彭志英.表面活性剂对土壤杆菌Q9415发酵3结论(1)通过对AB449、PGS两种表面活性剂的加产胶的影响J.食品科学,2004,25(5):141-143.13EnriqueGalindo,GuadalupeSa

33、lcedo.DetergentsimprovexanthanyieldandpolymerqualityinculturesofXanthomonascampestrisJ.EnzymeandMicrobialTechnology,1996,19(2):145-149.14AlkasrawiM,ErikssonT,Borjesson,etal.TheeffectofTween-20onsimultaneoussaccharificationandfermentationofsoftwoodtoethanolJ.EnzymeandMicrobialTechnology,2003,33(1):71

34、-78.15LeeSS,KimHS,MoonYH,etal.Theeffectsofanon2ionicsurfactantonthefermentationcharacteristics,microbialgrowth,enzymeactivityanddigestibilityintherumenofcowsJ.AnimalFeedScienceandTechnology,2004,115:37-50.16JiangSu,GuangYin,ZhouQi,etal.Biologicalshort2chainfattyacids(SCFAs)productionfromwaste2activa

35、tedsludgeaffectedbysurfactantJ.WaterResearch,2007,41(14):3112-3120.17KimuraE.Triggeringmechanismofl2glutamateoverproductionbyDtsR1incoryneformbacteriaJ.BiosciBioeng2002,94:545-551.18GandeR,GibsonKJ,BrownAK,etal.Acyl2CoAcarboxylases(accD2andaccD3),togetherwithauniquepolyketidesynthase(Cg2pks),arekeyt

36、omycolicacidbiosynthesisin入时间和加入剂量的单因素实验分析可知,AB449表面活性剂在菌种生长对数期3h加入体积分数为1125%,可以将谷氨酸的产酸率提高18169%,而在产酸初期12h加入体积分数为01020%的PGS,可以将谷氨酸产酸率提高16167%,可见,两种表面活性剂作为生产谷氨酸的发酵促进剂有显著效果。(2)考察了AB449、PGS两种表面活性剂同时加入的协同效应,结果表明,菌种对数生长期(第3h)加入体积分数为1125%的AB449,发酵中后期(第12h)加入体积分数为01020%的PGS,在不影响菌种生长的前提下,可促使谷氨酸产酸率由3105%提高到3

37、176%,较原产酸率提高了23128%,发酵周期由44h下降为36h,缩短了8h,有效提高了生产效率。参考文献:1钟声,朱建民,王伟.Gemini表面活性剂的研究进展C.2003表面活性剂技术经济文集,2003,65-70.2张志波,曾光明,时进钢,等.表面活性剂对栗褐链霉菌(streptomycesbadius)产酶的影响J.高技术通讯,2007,17(9):962-967.3刘佳,袁兴中,曾光明,等.表面活性剂对绿色木霉产纤维素CorynebacterianeaesuchasCorynebacteriumglutamicumandMycobacteriumtuberculosisJ.Bio

38、lChem,2004,279:44847-44857.19PortevinD,deSousa2DAuriaC,MontrozierH,etal.Theacyl2AMPligaseFadD32andAccD4containingacyl2CoAcarboxylasearerequiredforthesynthesisofmycolicacidsandessentialformycobacterialgrowth.Identificationofthecarboxylationproductanddeterminationoftheacyl2CoAcarboxylasecomponentsJ.Bi

39、olChem,2005,280:8862-8874.酶影响的实验研究J.中国生物工程杂志,2006,26(8):62-66.4刘军,陈向东,戴玄,等.表面活性剂对嗜热脂肪芽孢杆菌(下转第889页)© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 第9期高阳艳,等:Span60对32甲基吡啶电氧化的影响889表3中、及max与表2表示的意义相同。影响电流效率大小的最重要因素是n(32甲基吡啶)/n(硫酸),其他因素对电流效率影响大小的顺序依次是:电解电量>阳极电

40、位>Span60浓度反应温度。Span60浓度的变化对电流效率的影响不太大。总的来说,各项因素对电流效率的影响都不如对选择性的影响大。以电流效率为考核指标,电氧化反应的最佳条件是:n(32甲基吡啶)/n硫酸)=014,添加临界胶束浓度的Span60,反应温度15最佳反应条件是:n(32甲基吡啶)/n(硫酸)=014,添加高于或接近临界胶束浓度的Span60,反应温度15,阳极电位119210V,电解电量为理论电量的10%。选择性可达84141%,电流效率达49160%。(3)本课题组利用上述实验结果在250mL可循环电解池中进行了放大实验,其结果与小试基本相同,有很好的工业应用前景。参考

41、文献:1张玉敏,张恒彬,徐玉玲,等.不同电极材料和不同酸介质对32,阳极电位119V,电解电量为理论电量的10%。综合正交实验所得32甲基吡啶电氧化生成烟酸的选择性和电流效率影响因素分析结果,确定本反应的最佳反应条件是n(32甲基吡啶)/n(硫酸)=014,反应温度15,阳极电位为119210V,电解电量为理论电量的10%,添加高于或接近临界胶束浓度的Span60。在最佳反应条件下重复实验3次,选择性的平均值为84141%,电流效率平均值为49160%。这个结果与正交实验16214放大实验电解放大实验,80结果见表4。表4放大实验结果Table4Resultsofscale2uptestSelectivity/%12388137891568616488119Currentefficiency/%59152601795718859139甲基吡啶电氧化的影响J.高等学校化学学报,2005,26(1