猴免疫缺陷病毒外膜糖蛋白基因序列重组和突变克隆的转染研究

1、    猴免疫缺陷病毒外膜糖蛋白基因序列重组 和突变克隆的转染研究        【 摘要 】目的研究猴免疫缺陷病毒(SIV)外膜糖蛋白(envGP)基因片段与病毒复制功能的关系。 方法利用两病毒株共有的内切酶位点，将非致病性SIVmac 142株envGP区的DNA片段与致病性SIVmac 239株的对应区域进行置换，构成多个重组体。RFLP和部分序列测序确定后，用等量突变病毒(3g)转染CD4+T淋巴细胞CEM×174细胞系，用ELISA监测培养液中S

2、IV核心蛋白P27水平的变化，以判定重组病毒的复制能力。 结果与SIVmac 239株相比，SIVmac 239 envGP重组体(SIVmac142/239 envGP/142)仍保持高度的复制活性，SIVmac239gp41(SIVmac142/239gp41/142)或SIVmac239N-gp41(SIVmac142/239N-gp41/142)的复制能力明显降低，而SIVmac239C-gp41(SIVmac142/239C-gp41/142)重组体无复制活性。 结论envGP基因是SIVmac239株复制能力或毒力的重要调节因素。【 主题词 】猴免疫缺陷病毒； 外膜糖蛋白； 重组；

3、 转染； 病毒复制 Sequential recombination of SIV envelope protein (ENV) gene and study on transfection by the mutant clonesLIU Xiaomin, XU Ying, PAN Shangha（Laboratory of Molecular Biology, The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, P.R.China）【 Abstract 】ObjectiveTo study th

4、e relationship between DNA fragments in ENV gene of SIVmac and viral replicating ability. Methods Reciprocal recombinants were constructed by replacing the clonable DNA fragments of ENV region of the nonpathogenic SIVmac142 clone with the pathogenic SIVmac 239 clone. Following confirmation by RFLP a

5、nd partial sequence analysis, the aliquot mutant viruses (3g) were used to transfect CEM×174 cell line, and the concentration of SIVmac main core protein(P27) in culture supernatants was closely monitored by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in order to identify the replicating ability

6、of the mutants. ResultsCompared with SIVmac 239 clone, SIVmac 239 envGP recombinant (SIVmac142/239envGP/142) was still imbued with high replicating activity; and SIVmac239gp41 (SIVmac142/239gp41/142) or SIVmac239N-gp41 (SIVmac142/239N-gp41/142) with comparably decreasing activity, while SIVmac239C-g

7、p41(SIVmac142/239C-gp41/142) lacked replicating activity. ConclusionENV is an important regulating element to the replication or virulence of SIVmac239 clone.【 Subject words 】SIV; ENV; Recombination; Transfection; Viral replication猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency viruses SIV)是一组在致病性和毒力方面具有多样性的灵长类动物病毒

8、，其中，SIVmac239克隆感染的猴表现为与人类AIDS相似的疾病，称之为致病（或有毒）株，而SIVmac142克隆仅引起猴发生病毒血症，不发生临床综合征，称之为非致病（或无毒）株1。一般认为，外膜糖蛋白(envGP)在病毒的感染和免疫中起重要作用，而SIVmac239和SIVmac142克隆之间envGP区核苷酸的差别，是否提示SIVmac239克隆的致病性或毒力与envGP全区、部分或个别核苷酸有关，仍需要进一步研究2，3。本研究根据SIV基因组的内切酶谱，用致病性SIVmac239克隆的相应片段与非致病性SIVmac142克隆的envGP全区、gp41、N-gp41或C-gp41区进行

9、置换，并采用SIV基因组中Gag基因的产物SIV主要核心蛋白P27为指标，对重组病毒转染CD4+T淋巴细胞CEM×174细胞后的复制能力进行测定和比较。材料和方法主要试剂：限制性内切酶和T4连接酶(New England Bio-Lab)，感受态细胞和CEM×174细胞(Stratagene)，DNA序列分析试剂盒(USB)，35S -dATP(Amershan)，DNA纯化试剂盒(Bio101)，质粒PBS-SIVmac239半病毒克隆(P239-5，P239-3)和PBS-SIVmac142半病毒克隆(P142-5，P142-3)由New England提供，SIV核心

10、抗原P27酶联免疫分析试剂盒由美国马里兰大学免疫微生物系赠送。1P239-3和P142-3克隆间重组体构建示意Fig 1. Schematic construction of recombinants between P239-3 and P142-3 clone*: Unique Nhe site in LTR of P142-3 cloneRegional Primate Research Center半病毒重组体的构建：分别对P239-3和P142-3半病毒克隆进行完全或部分酶切，琼脂糖凝胶电泳分离并收集envGP区相应的片段，Na-glassmilk法纯化，将P239-3中的envGP

11、区全段，gp41区，N-gp41区或C-gp41区分别与P142-3 envGP区的相应片段互换，转化后，利用IPTG、X-gal和抗菌素双重筛选重组的半病毒克隆。酶切和测序鉴定：利用Nhe等内切酶，对重组体进行RFLP分析。采用双脱氧末端终止法测定克隆点交界区DNA序列，证实重组片段的正确性。重组病毒的构建：将经测序确定的重组体分别与SIVmac142-5半病毒克隆(P142-5)经Sph切点连接，形成完整的病毒重组体。转染试验：采用DEAE-dextran转染方法，用等量的重组病毒DNA(3g)分别转染CEM×174细胞，其过程按文献4方法进行。酶联免疫分析：每隔3d连续多次收集

12、转染后细胞培养介质，ELISA法测定SIV核心抗原P27的浓度，方法步骤大致同文献5。结果1.SIVmac239-142重组体的构建：根据SIVmac142和239株基因组的核苷酸序列谱，在两病毒envGP区的特定部位含有相同的内切酶位点，可以进行DNA片段的互换和克隆，在完全或不完全酶切后，电泳分离、收集、纯化所需的片段，用P239-3的envGP(Sph-Sac，64509230，2.78kb)、gp41(Ban-Sac，81709230，1.06kb)、N-gp41(Ban-Nhe，81708750，0.58kb)或C-gp41(Nhe-Sac，87509230，0.48kb)分别替换P

13、142-3的相对应片段，经转化、筛选、形成重组的半病毒克隆（1）。重组的半病毒克隆经Sph切点与SIVmac142-5相连形成4种完整的病毒重组体。包括：SIVmac239envGP(SIVmac142/239envGP/142)，SIVmac239gp41(SIVmac142/239gp41/142)，SIVmac239N-gp41(SIVmac142/239N-gp41/142)和SIVmac239C-gp41(SIVmac142/239C-gp41/142)。2.酶切、测序鉴定重组体：根据P142-3区长末端重复区(LTR)独具另一Nhe切点(9309)的特性，对重组的半病毒克隆进行Sp

14、h+Nhe酶切分析，电泳显示一约1.1kb的特异片段(82379309)，证实重组体3端下游LTR区为SIVmac142序列（2）。根据克隆点上、下游核苷序列设计引物如下：P1：5-ATCACTCCAATTGGCTTGGC-3(8109-8128)P2：5-GAATAGCTGGGATGTGTT-3(8621-8638)P3：5-GACAAGGGCTTGAGCTCACT-3(9217-9236)采用双脱氧末端终止法测定重组体内239-142交界区的DNA序列，证实重组序列的正确性。3.转染后SIVmac核心抗原(P27)的动态分析：用ELISA方法测定重组病毒转染后培养液中SIVmac主要核心蛋

15、白P27的浓度及其动态演变，以推测病毒复制能力的变化。结果显示：与SIVmac239株相比，SIVmac239envGP的复制能力无明显差异，而克隆转染后P27水平明显下降，但于转染后1821d时仍可达到试剂盒方法所界定的阳性复制水平(0.40ng/ml，见表1)5。SIVmac239C-gp41克隆与SIVmac142克隆一样，在转染后CEM×174细胞系中不具有复制活性（表1）。 2Sph、Nhe分析SIV半病毒重组体(P239envGP)Fig 2. Identification of SIV half virus recombinant(P239envGP) by Sph+N

16、heLane 1,2,3,4,5: P239envGP after Sph+Nhe digestion; Lane 6: -Hind DNA marker; Lane 7,8,9,10,11: P239envGP after Sphcomplete and Nhepartial digestionA: 1.1kb special fragment of Nhe-Nhe(82378309)B: 4.8kb fragement for P239C-gp41 cloning(reference Fig. 1)SIVmac239gp41或N-gp41 讨论SIV与人类免疫缺陷病毒(HIV)是在进化上高

17、度同源、在致病性上非常相似的灵长类病毒。对SIV的研究是人类探索AIDS病因、发病机制、治疗和预防的重要模型。SIV的envGP基因(gp160)主要由gp120和gp41两个区域构成，gp41拷贝转膜蛋白(TMP)，其分子结构的改变与SIVmac在人类细胞中的复制力不同有关6。在SIVmac239和SIVmac142两克隆之间，envGP区域核苷酸组成的差异和分布与envGP的功能或与病毒致病性的关系目前尚不清楚。P27是由SIV基因组中Gag基因拷贝的SIV主要核心蛋白(main core protein)。一般认为，Gag基因及其产物与envGP 、Pol和LTR等共同参与调节病毒的感染

18、和复制过程。研究表明，SIV感染的猴从急性期存活的现象看与病毒复制的降调节有关，同时伴有针对SIV envGP和Gag蛋白抗体的产生7。用酶联免疫法(ELISA)测定病毒原液、血浆或细胞培养介质中Gag蛋白P27(core protein P27)的浓度，具有使标本微型化，更简单经济等特点。且测定液中P27浓度与游离病毒的含量具有良好的一致性，它优于其它更间接测定SIV复制水平的方法，是一种敏感的量化指标5,7,8。本研究利用两种病毒克隆envGP区DNA片段的可互换性，成功地建立了SIVmac142239之间的多项重组体并进行了体外转染试验。在转染后，全envGP区重组体(SIVmac239

19、envGP)具有较强的复制活性；SIVmac239gp41克隆或SIVmac239N-gp41克隆的复制能力明显低于前者；而SIVmac239C-gp41克隆不具有复制能力。与国外同类研究相似，本研究结果提示，SIVmac239envGP基因区的组成和完整性与SIV的复制能力（或毒力）有关8-10。此外，多项重组体转染结果提示，envGP基因中N-gp41和gp120区域的核苷酸结构对维系envGP的功能更显重要。SIVmac239C-gp41克隆在转染后不具备复制活性，尚不能被清楚解释，是否间接提示N端gp41区的某些或个别核苷酸与病毒的复制力或毒力有关，需要PCR诱导突变等进一步研究。表1

20、免疫荧光法测定转染后培养液中SIV核心蛋白P27的浓度Table 1. Measurement of SIV core protein P27 in transfected culture medium by ELISASIV or recombinantSIV core protein P27Identificationof result#day3day6day9day12day15day18day21day24day27SIVmac2390.040.442.452.101.310.531.871.801.60(+)(150)*(1100)(1100)(1100)(1100)(1100)(1

21、100)SIVmac1420.040.040.030.020.020.050.010.090.07(-)SIVmac239envGP0.040.031.361.751.711.301.250.21(+)(1100)(1100)(1100)(1100)(1100)SIVmac239gp410.020.020.010.010.020.472.480.410.31(+)SIVmac239N-gp410.050.050.060.090.180.801.20(+)SIVmac239C-gp410.040.040.030.040.030.020.030.100.04(-) Wavelength 450-5

22、70nm, blank subtracted* Ratio of dilution with RPMI 1640# The point for positive level is above 0.40ng/ml 基金项目：国家教委留学归国人员基金资助项目刘晓民（哈尔滨医科大学第一医院分子生物室）徐莹（哈尔滨医科大学第一医院分子生物室）潘尚哈（哈尔滨医科大学第一医院分子生物室）毕丽（哈尔滨医科大学第一医院分子生物室）李言（美国马里兰大学免疫微生物系）参考文献1，Hirsch VM, Johnson PR. Pathogenic diversity of simian immunodeficien

23、cy viruses. Virus Res, 1994, 32:183-203.2，Sakai H, Sakuragi S, Sakuragi J, et al. Sequence responsible for efficient replication of SIV、SIVmnd in cell of the monocyte/macrophage lineage. J GenVirol, 1992，73：2989-2993.3，Regier DA, Desrosiers RC. The complete nucleotide sequence of a pathogenic molecu

24、lar clone of simian immunodeficiency virus. AIDS Res Hum Retroviruses, 1990, 6(11):1221-1231.4，Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.5，Lohman BL, Higgins J, Marthas ML, et al. Development of SIV isolation titration and neutralization assay which use whole blood from rhesus monkeys and a antigen capture enzyme-linked immunosorbent assay. J Clin Microl, 1991, 29:2187-219