碳酸氢钠注射液细菌内毒素检查法的研究

1、    碳酸氢钠注射液细菌内毒素检查法的研究        摘要本文利用自配的盐酸溶液（浓盐酸水5100）与碳酸氢钠注射液等体积混合，排除了样品对鲎试剂的抑制作用，使得可用细菌内毒素检查法代替碳酸氢钠注射液的热原检查法。关键词碳酸氢钠注射液鲎试剂细菌内毒素检查法干扰试验碳酸氢钠注射液用于静脉注射，中国药典1995年版规定用家兔做热原检查，但该法试验条件要求较高，操作繁烦，费时费力。能否用简便快速的细菌内毒素检查法替代热原检查法，已往的报道均证实了碳酸氢钠对鲎试剂的抑制作用，无

2、法用简单的稀释法排除干扰。本文根据鲎试验法原理并结合具体实验条件作了一些研究，采用盐酸溶液中和的办法排除了干扰，取得满意的结果，现报道如下。1实验材料细菌内毒素国家标准品（中国药品生物制品检定所，批号981，规格9000 EU支）；鲎试剂（均由福州东方鲎试剂厂提供，规格0.1 ml支）；细菌内毒素检查用水（福州东方鲎试剂厂，批号990205，内毒素含量0.03 EUml，规格2 ml支，下文简称BET水）；碳酸氢钠注射液（样品1：连云港正大天晴制药有限公司，批号9809301；样品2：安徽省阜阳制药厂，批号981207；样品3：莆田市医院制剂室，批号990316；以上规格均为250 ml：12

3、.5 g，热原检查均符合规定，临床使用无不良反应）；浓盐酸（三明市三元化学试剂厂，批号970714，规格500 ml瓶，含HCl3638，化学纯）；氢氧化钠（蚌埠电化试剂厂，批号970803，规格500 g瓶，分析纯）。SZK-202净化工作台（蚌埠绝缘材料厂）；ZD-2酸度计（上海第二分析仪器厂）；XW-80A旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）；定量加液器（上海金林生化试剂仪器厂，经用BET水比对，各档误差均在1.0以内）。其余玻璃器具均按规定方法1处理。2试验方法及结果2.1鲎试剂灵敏度复核结果（见表1）。表1鲎试剂灵敏度复核结果鲎试剂批号标示值b（EUml）测定值c（EUml）标准差s99

4、01260.50.509902040.50.7070.1749904120.50.509901180.250.2509903100.1250.12502.2盐酸溶液浓度确定碳酸氢钠与盐酸反应生成中性的氯化钠和水并放出二氧化碳。为方便使用，拟定样品与盐酸液等体积混合后检测，相当于样品被2倍稀释，这时选择鲎试剂较为容易。经计算，浓盐酸（37）水595（VV）的盐酸溶液与等体积5碳酸氢钠注射液正好中和完全，为防止极限状况下混合液过份偏酸而超出鲎试剂的缓冲能力范围，本实验配制浓盐酸水5100（VV）的盐酸溶液（下文简称酸液）。测定各批样品与酸液等体积混合前后的pH值，同时测定了各样品的含量，结果（见表

5、2），证明了酸液浓度是合适的。表2样品含量及混合前后pH值样品编号含量（标）混合前pH值混合后pH值样品1100.88.067.14样品299.08.025.12样品398.48.244.482.3自配酸液的阳性、阴性试验取用BET水溶解的饱和氢氧化钠溶液0.15 ml置试管中，加入用BET水稀释10倍的酚酞指示液0.05 ml，再加BET水4.8 ml配成碱液。取浓盐酸0.25 ml加5 mlBET水配成酸液，缓缓加入上述碱液中至浅红色刚好消失，成为11的中和液。取此中和液作为溶剂，制备2b浓度的内毒素溶液，对各批鲎试剂进行阳性和阴性试验，每份平行做4管，阴性管保温4 h，结果（见表3），证

6、明自配的酸液不会引入细菌内毒素。表3酸碱中和液的阳性、阴性试验结果（n3）鲎试剂批号标示值b（EUml）阳性管浓度（EUml）结阳性果阴性9901260.51.0449902040.51.0449904120.51.0449901180.250.5449903100.1250.25442.4干扰试验药品细菌内毒素限值LKM，静脉注射时K取5EUml，M10 mlkg，得L0.5 EUml。试验中样品加入等体积酸液中和，相当于样品被2倍稀释，使用0.1 ml支、0.5 EUml鲎试剂时，采取不加0.1 ml BET水复溶而直接加0.2 ml混合液检测，使得L值与b值相当，具体试验设计如下：取浓盐

7、酸0.5 ml加10 ml BET水配成酸液，取酸液10 ml与样品10 ml缓慢混合均匀，置旋涡混合器上2 min，充分混匀并排尽生成的气体。以此混合液配制含细菌内毒素0.5 EUml、0.25 EUml、0.125 EUml、0.0625 EUml系列浓度的溶液对b为0.5 EUml和0.25 EUml的鲎试剂进行干扰试验；上述系列浓度溶液经BET水2倍稀释后对b为0.125 EUml的鲎试剂进行干扰试验。结果（见表4），证明样品经酸液中和后不干扰鲎试剂的凝胶化过程。表4碳酸氢钠注射液加酸中和后干扰试验结果样品编号鲎试剂批号标示值b（EUml）加BET水复溶（ml）加系列内毒素浓度中和液（

8、ml）测定值c（EUml）标准差s样品19901260.500.20.509902040.500.20.7070.1749904120.500.20.509901180.250.10.10.2509903100.1250.10.10.1250样品29901260.500.20.509902040.500.20.5950.1509904120.500.20.509901180.250.10.10.2509903100.1250.10.10.1490.150样品39901260.500.20.509902040.500.20.7070.1749904120.500.20.509901180.250

9、.10.10.2509903100.1250.10.10.1490.1502.5检查法根据以上实验结果，拟定样品的检查方法如下：精密吸取浓盐液0.1 ml，加BET水2 ml配成酸液。取样品1 ml置试管中，加酸液1 ml混匀，置旋涡混合器上2 min，排尽生成的气体，以此混合液作为供试品溶液，同时做供试品阳性和阴性对照，试验设计和结果（见表5），与热原检查结果一致，证明本方法切实可行。 表53 批 碳 酸 氢 钠 注 射 液 细 菌 内 毒 素 检 查 结 果（n3）鲎试剂批号标示值b（EUml）加BET水复溶（ml）中和液稀释倍数混合液加入量（ml）结果阳性管样品管阴性管9901260.5

10、010.29902040.5010.29904120.5010.29901180.250.110.19903100.1250.120.13讨论3.1碳酸氢钠注射液经8倍稀释仍会抑制灵敏度为0.0625 EUml的鲎试剂而出现假阴性2，有报道3经10倍以上稀释后不抑制b0.125 EUml的鲎试剂，但这在实际检测中是不合理的。本文干扰试验表明，使用盐酸中和的方法是简单可行的。3.2碳酸氢钠与盐酸的中和反应为等摩尔数反应。合格的碳酸氢钠注射液含量为0.565 molL0.625 molL，国标浓盐酸水5100的酸液含HCl为0.555 molL0.585 molL。当两者等体积混合后，极限情况下，偏酸时混合液pH值约为2，但当样品含量（标）达98.0 以上时，pH值将3，达到鲎试剂的缓冲能力范围以内；而偏碱时，极限值为混合液仍含0.035 molL的碳酸氢钠，但此浓度相当于样品被稀释17倍，不会形成干扰。为防止样品含量低限和自配酸液误差较大的影响，建议在混合后用pH试纸测定一下pH值，然后酌情加入少量样品或酸液调节pH值至6.57.5再进行检测，保证结果的可靠性。3.3细菌内毒素为一种脂多糖，在浓盐酸和饱和氢氧化钠溶液中被分解破坏而失活，故在实验室中可自配酸液进行试验，表3结果也证明了这一点。如能由鲎试剂厂家配套供应含HCl0.565 molL的去除内毒素的酸液，