菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响

1、菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响 实验研究内容：（1） 菠萝蛋白酶活力测定方法的确定；（2） 菠萝蛋白酶的稳定性研究；（3） 菠萝蛋白酶的纯化；（4） 菠萝蛋白酶的修饰；（5） 修饰酶与修饰酶的活力比较。参考文献：提取菠萝酶工艺的研究胡莉娟，杨凌职业技术学院药物工程系 菠萝蛋白酶的提取及其在医药中的应用李淑喜，黎新明不同金属离子对菠萝蛋白酶活性及热稳定性的影响曾霖霖，黄惠华 聚乙二醇对菠萝蛋白酶的化学修饰吉林大学生命科学学院1、菠萝蛋白酶的提取纯化：单宁沉淀法：原理:菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白质, 广泛存在于菠萝果实、芽、叶、茎中, 分子量为33 000, 能分解蛋白质和酰胺等。它

2、的水解活性较木瓜酶高10 倍以上。因此有广泛的用途。它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清. 还用于胶、水解蛋白的生产, 在医药上它可在生物体内溶解纤维蛋白及血凝块。因此可以治疗水肿及多种炎症, 它能迅速溶痂。对正常组织无害, 不影响植皮, 适用于中小面积深度烧伤的治疗。1.1技术路线：鲜果皮汁（加5%苯甲酸钠液，混匀10min）混合液（离心4000rmp，7min）上清液（加入单宁液，边加边搅15min）酶糊复合物（离心4000rmp，5min）沉淀物1.2操作要点:（1）菠萝蛋白酶的提取称取1 kg制备好的鲜果皮汁, 加5% 苯甲酸钠溶液10 ml搅匀, 以4 000 r/ min

3、心7 min, 取上清液倒人干净烧杯中,每个烧杯中100ml溶液。缓缓加入0.2%单宁溶液10 ml, 边加边拌约1 5min, 沉淀物析出, 静止40 min。虹吸除去上清废液, 把酶复合沉淀物倒入离心杯中, 以4 000 r/ min。离心5 min, 倒掉上清废液, 得到酶糊复合物。(2)分离、洗涤和保护把提取的蛋白酶糊倒入烧杯中, 加0. 1% EDTA 溶液100 ml 搅匀, 再将1. 5% 氯化钠溶液200 ml 倒人烧杯中搅匀, 以4 000 r/ min离心7 min, 倒掉上清废液, 得到洗涤剂酶复合沉淀物。把洗涤剂酶复合沉淀物倒入烧杯中, 加0. 5% 乙酸锌溶液20 m

4、l, 搅拌均匀, 静止5 min,加0. 06%抗坏血酸溶液30 ml, 搅匀, 静止5 min,加1. 5% 氯化钠溶液20 ml, 搅匀, 静止5 min, 最后再加0. 5% EDTA 溶液20 ml, 搅匀, 静止5min, 以4 000 r/ min 离心7 min, 把上清废液倒掉, 得到洗涤剂酶复合沉淀物。把洗涤剂酶复合沉淀物倒入烧杯中, 加0. 5% 硫代硫酸钠溶液20 ml, 搅匀, 静止5 min;加1% L- 半胱氨酸溶液10 ml, 搅匀, 以4 000 r/min 离心7 min, 倒掉上清废液, 最后得到蛋白酶糊。冷冻、干燥把提取的酶糊放入冰室中( - 12e )

5、, 低温冷冻15 20 h, 取出解冻, 离心得酶膏,把酶膏倒人装有氯化钙或五氧化二磷的干燥器中干燥6 10 h 得干酶, 研磨成粉状, 低温保存。纯化离子交换技术已经成为分离提取生物大分子的有效方法。与化学方法相比，它分离条件温和，不引起分子结构的变化。它用于纯化菠萝蛋白酶的关键问题是选择合适的交换树脂及相应的交换条件。1 试剂与仪器菠萝蛋白酶粗品、葡糖醛酸对照品、牛血清白蛋白对照品为生化试剂。离子交换柱(250×10mm)；紫外检测仪(Hitachi Instruments Inc)；蠕动泵(东方科学仪器厂)；自动部分收集器(上海东风电讯仪器厂)；红外吸收光谱仪(Perkin E

6、lmer 783)；紫外吸收光谱仪(岛津UV-210A)。2 实验方法2.1 层析分离纯化经预处理的强酸型阳离子树脂和经组氨酸修饰后的强碱型阴离子树脂分别装入250mm×10mm的离子交换柱和离子交换层析柱，柱的长径比为201，将 两柱串联。在常温下依次操作：加样：用移液管量取菠萝蛋白酶粗品溶液，从交换柱顶部加入。洗脱：用蠕动泵连续加入氯化钠溶液洗脱。部分收集：用自动部分收集器收集部分洗脱流出液。检测：洗脱流出液连续通过紫外检测仪，在选定波长下测定其吸光度A，并 自动绘制洗脱曲线。洗脱流出液经沉淀、干燥，得到HA精品。2.2 测试方法葡糖醛酸含量测定：参照Bitter-Muit 的咔

7、唑法测定，与葡糖醛酸对照品对照。 蛋白质含量测定：参照Lowry法测定，与牛血清白蛋白对照品对照。黏度及分子量的测定：参照Shimada法，采用乌氏粘度计。参比液为pH7.3的0.2mol/L磷酸盐缓冲液，测定温度28±0.05，三点外推至比浓度为0，求出 特性黏数，并计算出分子量。红外吸收光谱(KBr 压片)：分辨率为2.4cm-1，在4000cm-1400cm-1范围扫 描。紫外吸收光谱：扫描范围190nm,300nm,扫描速度为100nm/min。2、NEM对菠萝蛋白酶的修饰：60gNEM溶于40ml干燥吡啶，加入1.01g琥珀酸酐，60度保温2h，在60度减压蒸馏除去溶剂。加

8、入苯至残余物溶解，再加100ml冷己烷，4度振荡2h。过滤，残渣溶于蒸馏水后透析，冻干。将其与菠萝蛋白酶按配比投料，加入0.1mol/L柠檬酸缓冲液（PH 3.0），4度反应4h。产物在PH 4.6柠檬酸缓冲液中透析，冻干后得NEM-菠萝蛋白酶（修饰酶）。3、修饰酶与未修饰酶活性比较：3.1测定原理：菠萝蛋白酶将酪蛋白分解，生成在三氯乙酸溶液中不沉淀的多肽，并在275 nm处有吸收峰，除去未被消化的酪蛋白，用分光光度计(275 nm)测定溶液中所含肽的数量。蛋白酶活力单位的定义为：在一定温度和pH值条件下，l min水解酪蛋白产生l g酪氨酸为l个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。3.2步骤：（1）分别取修饰酶与未修饰酶，溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液中（PH 7.0）至10ml，离心得上清液（2）取1