虎杖苷对烧伤血清和LPS作用下大鼠平滑肌细胞蛋白激酶C活性的

1、    虎杖苷对烧伤血清和LPS作用下大鼠平滑肌细胞蛋白激酶C活性的影响(1)    】 目的:观察虎杖苷(PD)对烧伤血清和脂多糖（LPS）作用下大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）蛋白激酶C（PKC）活性的影响，探讨其抗休克的机制. 方法:取大鼠胸主动脉培养VSMC，用烧伤血清和LPS刺激VSMC后，闪烁计数仪测定PKC活性. 结果： 烧伤血清作用后VSMC胞质PKC的活性下降(vs正常组P<0.05)，但胞膜的PKC活性上升（vs正常组P<0.05），经PD治疗后胞质PKC的活性上升（vs烧伤组、治疗对

2、照组P<0.05，vs正常组P>0.05），胞膜的PKC活性下降（vs烧伤组、治疗对照组P<0.05, vs正常组P>0.05）. LPS刺激后VSMC胞质与胞膜PKC的活性均上升（vs正常组P<0.05），经PD处理后其活性又均下降（vs LPS组、治疗对照组P<0.05，vs正常组P>0.05）. 结论： PD对烧伤血清和LPS作用下的VSMC的保护作用可能是通过调节PKC的活性来发挥作用的，这可能是其抗休克的分子机制之一.    【关键词】 烧伤；脂多糖；平滑肌细胞；虎杖苷；蛋白激酶C  

3、;  0引言    虎杖苷(polydatin, PD)是从中药虎杖中提取的主成份，在体动物实验表明PD对烧伤性、感染性休克有良好疗效，治疗休克动物的存活时间和存活率均明显优于6542和多巴胺1. 平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)在小血管的收缩扩张中占据着主导地位，而蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）的活性则对VSMC的收缩功能起着重的调节作用2. 对于感染性休克来讲，细菌内毒素起了重的作用，内毒素的主成份为脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，因此我们用LPS刺激

4、大鼠SMC来模拟感染性休克，同时，我们也应用烧伤血清刺激SMC来模拟烧伤性休克，观察了PD在此种情况下对SMC PKC活性的影响，以探讨PD抗休克的作用机制.1材料和方法    1.1材料清洁级SD大鼠，40只，体质量180220 g，雌雄不拘，由南方医科大学实验动物中心提供. PD由校化学教研室提纯制备. LPS(浓度2.5 g/L)，磷脂酰丝胺酸（phosphatidylserine, PS）,组蛋白S型（histone）,苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF）和Triton X100购自Sigma公司

5、. 胎牛血清（杭州四季青公司）. 32PATP, ATP(250 mmol/L), CaCl2, MgCl2, DTT, Hepes, 蔗糖，TrisHCl, EGTA, EDTA, 乌拉坦, 氯醛糖等均为国产试剂. PD用DHanks液配制成2 mmol/L，避光保存. PS用氯仿配制成2 g/L，避光贮于-20. PMSF用异丙醇配制成100 mmol/L，-20保存. LS6500型液体闪烁计数仪（Bechman公司，测量PKC的活性），低温高速离心机（Bechman Avanti J25, 提取PKC用）.    1.2方法作者：王月刚，金春华，

6、黄海潇，吴平生【关键词】虎杖苷基金项目：国家自然科学基金【Abstract】AIM: To explore the         本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。        1.3分组实验分两部分，一部分为烧伤血清刺激，一部分为LPS刺激，n=5. 烧伤血清刺激分正常组（不加任何

7、处理因素），烧伤组（大鼠烧伤血清刺激1 h，血清浓度为200 mL/L），治疗组（在烧伤组处理完毕后加PD治疗2 h，PD终浓度为0.4 mmol/L），治疗对照组（在烧伤组处理完毕后加与PD等量的DHanks，作用2 h）；LPS刺激分正常组（未做任何处理），LPS刺激组（加入LPS使其终浓度为100 g/L，刺激30 min），治疗组（在LPS刺激组基础上加PD，终浓度为0.4 mmol/L，作用2 h），治疗对照组（在LPS刺激组基础上加与PD等量的DHanks，作用2 h）.    统计学处理： 结果用x±s表示，应用SPSS 10.0

8、统计软件进行单因素方差分析.2结果    2.1PD对烧伤血清刺激后SMC胞质及胞膜PKC的影响胞质：烧伤组的PKC活性比先前有所下降，与正常组比较P<0.05. 经PD治疗后PKC的活性有所上升，与烧伤组比较P<0.05，与正常组相比P>0.05. 而治疗对照组的活性上升更高, 与烧伤组和治疗组比较P<0.05. 胞膜：烧伤可以使胞膜PKC的活性上升，P<0.05. 而经PD治疗后PKC的活性有所恢复，与烧伤组相比较P<0.05. 而治疗对照组的PKC活性与治疗组相比较P<0.05，与烧伤组比较P>0.0

9、5(表1).    2.2PD对LPS刺激下SMC胞质及胞膜PKC活性的影响胞质：LPS刺激后细胞胞质PKC的活性升高，与正常组相比P<0.05. 经PD治疗后PKC活性有下降，与LPS刺激组相比P<0.05，而治疗对照组PKC活性没有恢复. 胞膜：SMC胞膜PKC的活性也上升，与正常组相比P<0.05. 经PD治疗后PKC的活性有所下降，与LPS刺激组相比P<0.05. 不同的是治疗对照组的PKC活性下降更明显，与治疗组和正常组相比P值均<0.01(表1).表1虎杖苷(PD)对烧伤血清及脂多糖（LPS）刺激下大鼠平滑肌细胞

10、(SMC)蛋白激酶C活性的影响3讨论    本实验中，烧伤血清刺激VSMC 2 h后, 胞质的PKC活性下降，胞膜PKC的活性上升，表明烧伤血清的作用主是促进PKC的激活转位. 而PD处理则减低了胞膜PKC的活性，升高了胞质中PKC活性. 表明PD可对抗烧伤血清引起的PKC异常变化. 实验中我们还发现治疗对照组的胞质PKC活性升高很多. 其原因可能为，治疗对照组是在烧伤血清的基础上加DHanks液，并没有去除烧伤血清，使烧伤血清的刺激作用长期存在，导致大量脂质氧化物质的产生，这些物质可以显著减慢DAG的降解2,5，从而持续不断的激活PKC，使胞质中PKC

11、的活性持续升高，提示PD对烧伤治疗的机制可能与其调节PKC的活性有关. 它通过维持PKC活性的稳定来减轻机体的损伤.    在感染性休克发生过程中，LPS是主的致病因素. 从本实验结果来看，LPS刺激VSMC后，细胞胞质和胞膜的PKC活性均升高，表明LPS引起的损伤效应至少有部分是通过PKC信号系统介导的. 其激活PKC的机制可能有以下几方面6：LPS能直接引起肌醇磷脂分解产生DAG，从而激活PKC；同时LPS与十四佛波乙酸酯相似，有可能以佛波酯类物质的方式直接激活PKC；此外，它还可以使机体释放大量血管紧张素、儿茶酚胺等因子，这些因子也能引起细胞膜肌醇

12、磷脂分解产生DAG，进一步激活PKC.    LPS损伤的VSMC给予0.4 mmol/L PD作用后，细胞质和细胞膜PKC的活性均减低. 提示PD可能是通过影响PKC的活性来对抗LPS的损害作用，但是PD是通过什么机制调节PKC的活性还不太清楚. 对于治疗对照组，其胞质的PKC活性与LPS组相比没有太大变化，而胞膜的PKC活性降低较显著，这可能是由于PKC的耗竭机制和自我反馈机制而导致. 由于LPS的刺激在对照组并没有去除，其持续刺激一方面导致PKC的大量消耗，到后期没有足够的PKC从胞质转位到胞膜上，另外一个方面可能是由于PKC活性的升高反馈性的抑制

13、了胞膜PKC的活性，从而降低了胞膜PKC的活性5.    但是与烧伤损伤不同的是，LPS激活后的PKC并没有使平滑肌的收缩性增强，反而使其收缩性下降5. 这可能是由于LPS激活的PKC同工酶与其它损伤所激活的同工酶不同，进而导致其作用底物不同而致. PKC的同工酶不少于12种，其中cPKC包括PKC,和，而nPKC则包括PKC，和. 在LPS刺激SMC时，主是PKC，和被激活. PKC的磷酸化使诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活化，iNOS的增加导致了NO的大量合成，NO为强烈的舒血管因子，可以使血管强烈扩张. 由于LPS持续的刺激，PKC被持续激活，iN

14、OS也就大量产生，使NO在胞内的含量增加，从而导致了SMC收缩性的下降.【参考文献】    1 黄巧冰，赵克森，黄绪亮. 虎杖4号与多巴胺、6542治疗大鼠失血性休克疗效的比较J. 微循环学杂志， 1995, (1): 7-9.    2 Begum N, Duddy N, Sandu O, et al. Regulation of myosinbound protein phosphatase by insulin in vascular smooth muscle cells: Evaluation of th

15、e role of rho kinase and phosphatidylinositol3kinasedependent signaling pathwaysJ. Mol Endocrinol, 2000, 14(9):1365-1376.    3 鄂征. 组织培养和分子细胞学技术M. 北京:北京出版社, 1995: 131.    4 Pease DC, Paule WJ. Electron microscopy of elastic arteries; the thoracic aorta of the r

16、atJ. J Ultrastruct Res, 1960, 3: 469-483.            作者：王月刚，金春华，黄海潇，吴平生【关键词】虎杖苷基金项目：国家自然科学基金【Abstract】AIM: To explore the         本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。    5 Ha H, Yu MR, Choi YJ, et al. Activation of protein kinase cdelat and cepsilon by oxidative stress in early diabetic rat kidneyJ. Am J Kidney Dis, 2001,38(supp