凝血酶对大鼠星形胶质细胞组织因子活性表达的影响及其机制

1、    凝血酶对大鼠星形胶质细胞组织因子活性表达的影响及其机制          摘要目的:观察凝血酶对大鼠星形胶质细胞组织因子活性表达的影响及其机制 。方法：培养Wistar乳鼠星形胶质细胞，细胞用抗神经胶质纤维酸性蛋白单克隆 抗体确认。细胞冻融液组织因子活性检测采用一期血浆复钙时间法。结果：与 对照组比较，凝血酶使星形胶质细胞组织因子表达明显增高(P005)。当凝血酶与三 氟吡啦嗪或H7联用时，它对星形胶质细胞表达组织因子活性的刺激作用受到抑制。与凝血 酶组比较

2、，已酮可可碱十凝血酶组星形胶质细胞组织因子活性表达明显下降。结论： HTK凝血酶能刺激星形胶质细胞表达组织因子活性，三氟吡啦嗪、H7、己酮可可碱可抑制 凝血酶的这种刺激作用。关键词：星形胶质细胞;组织因子;凝血酶;己酮可可碱中分类号：Q421文献标识码：A文章编号：10 00-6834(2000)01-0006-04EFFECT OF THROMBIN ON THE TISSUE FACTOR EXPRESSION OF ASTROCYTESZHU Fa-ming1, WEN Zhi-bin2, HE Xiao-fan2, LI Jun-cheng2, HE Shi-lin2(2.Depart

3、ment of Physiology, Hunan Medical Unversity, Changsha 41 00 78;1.Blood Centre of Zhejiang Province, Hangzhou,310016)ABSTRACTAim:The present study was to observe the effect of thromb in on the tissue factor (TF) expression of astrocytes.Methods:To cu lture astrocytes of neonatal wistar rat, the astro

4、cytes were identified with an ti-glial fibrillary acidic protein monoclonal antibody. The TF activity of cel l lysate was measured with one stage recalcificate method.Results: As compared with the control group, the TF activity expression of astrocytes in creased siginificantly (P<0.05) in the th

5、rombin group. When thrombin was com bined with trifluoperazine (TFP) or H7, the inductive effect of thrombin was m arkedly inhibited. In contrast to the thrombin group, thrombin plus pentoxifylli ne (PTX) siginificantly decreased the TF activity of astrocytes (P<0.05).Conclusions:Thrombin can ind

6、uce the TF expression of astrocytes. TFP, H 7 or PTX can inhibite the inductive effect of thrombin.KEY WORDS： astrocyte;tissue factor;thrombi n; pentoxifylline组织因子(tissue factor，TF)是一种跨膜的单链蛋白质，在外源性凝血途径中起重要的作 用。正常人体血浆中仅含有极微量的TF，但在血管壁受损或在某些病理条件下，内毒素和凝 血酶等可刺激血管内皮细胞表达TF1-2。早已证实脑组织中含有丰富的TF，但新 近研究才表明脑组织中星

7、形胶质细胞能大量表达TF3，目前国内外对于星形胶质 细胞表达TF的影响因素尚未见报道。为观察凝血酶作为刺激物对星形胶质细胞表达TF的影响 及其可能机制，本室进行了以下实验，现报道如下。1材料与方法11试剂和药品DMEM细胞培养液干粉、钙调素阻断剂三氟吡啦嗪(trifluoperazine，TFP)、蛋白激酶C抑制 剂H7、己酮可可碱(pentoxifylline，PTX)、兔抗鼠神经胶质纤维样酸性蛋白单克隆抗体 、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG抗体均为美国Sigma产品；凝血酶为中国医学科学 院血液学研究所产品； dansyl-Glu-Gly-Arg-chloromethyl k

8、etone a(DEGR-a)由 Taylor惠赠；抗组织因子单克隆抗体由Morrissey惠赠。12细胞培养方法按Hertz等报道的方法略加以改进4培养Wistar乳鼠(出生后24 h内)星形胶质细胞 。由于星形胶质细胞能特异性分泌神经胶质纤维样酸性蛋白(glial fibrllary acidic pro tein，GFAP)，故采用GFAP抗原间接免疫荧光法进行确认。13实验方案将同源传代的单层星形胶质细胞接种于24孔板上，每孔接种细胞数为5×104,37、5CO 2饱和湿度下培养。待细胞完全融合成片，去培养液，用D-Hanks液洗涤3遍。然后分组 加入含不同刺激物的完全DME

9、M 1 ml。对照组加完全DMEM 1 ml。37、5CO2饱和湿 度培养培养相应的时间后，制备细胞悬液，贮存于-40待测3。14TF检测方法141星形胶质细胞冻融液促凝活性的测定采用一期凝固法3 。142TF活性确认方法为确认星形胶质细胞冻融液的促凝活性来自TF， 本实验从生物活性与抗原特异性两方面加以证实5005，则两两比较用q检验，P005表示具有 统计学意义。 2结果21星形胶质细胞鉴定使用抗GFAP单克隆抗体组在荧光显微镜下可见99以上的细胞呈现黄色荧光，而无单克隆 抗体组在荧光显微镜下无荧光表现，表明培养的细胞绝大多数属于星形胶质细胞。用各刺激 物后镜下观察细胞形态无明显的变化。2

10、2TF活性确认221DEGR-a对兔脑凝血活酶和星形胶质细胞冻融液促凝作用的影响DEGR-a是经化学修饰的因子a，它能特异性结合TF，但形成的TF/DEGR-a复合物丧 失了对因子X的催化作用，不能启动凝血过程。从1可见，加入DEGR-a(终浓度为46 g /ml)阻断TF作用后，各种稀释度的兔脑凝血活酶与星形胶质细胞冻融液的促凝活性均完全丧 失，与盐水血浆凝固时间相对照无明显的差异(P0.05)。由此可见，星形胶质细胞冻 融液与兔脑凝血活酶一样，它们的促凝活性都来自TF。22.2抗TF单抗对兔脑凝血活酶和星形胶质细胞冻融液生物活性的影响 加入兔脑凝血活酶或大鼠星形胶质细胞冻融液的血浆，凝固时

11、间在加入抗TF单抗(终浓度0 25 g/ml)后均明显延长,并且随促凝物稀释度加大，凝固时间延长，二者间存在明显的相 关性(r=0989，P005，表1)。这表明星形胶质细胞冻融液中促凝活性与兔脑凝血 活酶一样，均来自TF。Tab.1Effect of TF monoclonal antibody on the procoagulant activity of the rabbit thromboplastinand astrocyt es lysate(clotting time,s)Pooled human plasmaDilution11121418116salineRabbit thr

12、omboplastinwithout TF McAb49. 055.064.077.0105.0232.0with TF McAb58.376.087.0112.0142.0230.0Astrocytes lysatewithout TF McAb587695885107.0123.0232.0with TF McAb825946120515451815230.0     Fig.1Effect of DEGR-a on the procoagulant activity of rabbit thromboplastin and astrocytes l

13、ysate 23凝血酶对星形胶质细胞表达TF的剂量效应曲线加入凝血酶后，细胞培养时间为24 h。实验结果表明凝血酶具有明显的刺激作用，随着凝血 酶剂量的增加，星形胶质细胞表达TF活性明显增加(2)。24己酮可可碱(PTX)对星形胶质细胞表达TF活性的剂量效应曲线实验过程中加入已酮可可碱后，细胞培养时间为24 h。结果表明小剂量己酮可可碱无明显抑 制作用，只有大剂量己酮可可碱能明显抑制星形胶质细胞表达TF(3)。     Fig.2Dose-effect curve of th rombin on the expression TF of astrocyt

14、es25凝血酶与己酮可可碱对星形胶质细胞表达TF活性的影响实验过程凝血酶终浓度为10 IU/ml，己酮可可碱为5000 mol/L。加入刺激物后，细胞培养 时间为24 h。与对照组比较，凝血酶组星形胶质细胞表达TF活性明显增高(P0.05)， 已酮可可碱组星形胶质细胞表达TF活性明显降低(P005)，两者合用星形胶质细胞表 达TF明显降低(P005)。与凝血酶组比较，凝血酶+己酮可可碱组星形胶质细胞 表达TF明显下降(P001，表2)。2.6H7和TFP对凝血酶刺激星形胶质细胞表达TF的影响实验过程中凝血酶终浓度为10 IU/ml，H7为200 mol/L，TFP为50 nmol/L。加入各药

15、物 以后，细胞培养时间为6 h。与对照组比较，凝血酶组星形胶质细胞表达TF明显增加(P 005)；与凝血酶组比较，凝血酶+H7组星形胶质细胞表达TF明显下降(P 005) ，凝血酶+TFP组星形胶质细胞表达TF明显下降(P005，见表3)。Tab.2 Effect of thrombin and pentoxif ylline on the GroupTF(mU×102ml)Control315±22Thrombin478±3.8*PTX156±3.1*Thrombin+PTX168±41#     *P

16、005， vs control#P005, vs thrombin     Fig.3 Dose-effect curve of p entoxifylline on the expression TF of astrocytes3讨论近年来的大量研究表明，与内在凝血途径相比，组织因子途径(外源性途径)在生理性止血过 程与病理过程的血栓形成中具有更为重要的意义1，2。TF和因子a结合可启动 外源性凝血途径，导致凝血酶的形成。现己证明凝血酶可诱导血管内皮细胞和单核细胞表达 TF，且能加强血小板对血管内皮细胞表达TF的作用。本实验结果则表明，凝血酶能刺激星形

17、 胶质细胞表达TF，并呈现明显剂量关系。由于脑组织中存在大量的TF，新近也报道神经元和 胶质细胞均表达凝血酶原的mRNA6，因此当脑内一旦受损出血，大量的TF就可能 激活外源性凝血系统，在局部很快形成微量的凝血酶。微量的凝血酶可正反馈刺激星形胶质 细胞表达TF增多，TF与因子a结合可进一步启动外源性凝血系统，使凝血酶的生成大大 增 加，从而加快在出血局部的止血。但是凝血酶的形成也有不利的方面，局部形成的高浓度凝 血酶不仅使神经轴突回缩，突触传递障碍；而且使星形胶质细胞变形，神经营养与屏障功能 受损，同时引起星形胶质细胞增殖8，某些脑出血患者预后不良可能与此变化 有 一定的关系。Tab.3Eff

18、ect of H7GroupTF(mU×102ml)Control70±12Thrombin197±19*Thrombin+H7107±20#Thrombin+TFP88±09#     *P<005，vs control；#P<005， vs thrombin group 钙/钙调素(Ca2+CaM)与蛋白激酶C(PKC)途径是两条重要的信号传导途径。研究 表明 ，凝血酶刺激内皮细胞和单核细胞表达TF与这两条途径有关5，7。本实验结果 表明，凝血酶刺激星形胶质细胞TF表达可能也与此有关。由于

19、TF的表达可启动组织因子凝血 途径形成凝血酶，而脑内局部过量的凝血酶可引起中枢神经系统的损伤，因此阻断Ca2+ /CaM与PKC途径的药物对于脑出血病人的预后可能有所帮助。已酮可可碱是甲基黄嘌呤衍生物，已广泛应用于临床，它能有效改善血流，尤其是对缺血区 微血管血流的改善。已酮可可碱可抗血栓形成，明显抑制ADP诱导的脑梗塞和一过性脑缺血 患者的血小板聚集。已有研究表明，已酮可可碱能抑制脂多糖诱导的单核细胞组织因子的表 达9。本实验结果表明,单用已酮可可碱可抑制星形胶质细胞表达TF，并呈现明显 的剂量效应；凝血酶可刺激星形胶质细胞表达TF，己酮可可碱则明显抑制凝血酶的这种作用 。已有研究表明已酮可

20、可碱能抑制磷酸二脂酶，使细胞内的cAMP含量增高，其抑制星形胶质 细胞的TF表达也可能与此机理有关。已酮可可碱能抑制基础条件下星形胶质细胞表达TF和凝 血酶对星形胶质细胞的刺激作用，它的这一作用是否与其能改善血流和抗血栓形成的功能有 关有待于进一步研究。 基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600197)作者简介：朱发明(1970-)，男，湖南人，讲师，硕士，从事止血生理研究朱发明(浙江省血液中心，杭 州 310016)文志斌(湖南医科大学生理教研室，长沙410078)何晓凡(湖南医科大学生理教研室，长沙410078)李俊成(湖南医科大学生理教研室，长沙410078)贺石林(湖南医科大学生

21、理教研室，长沙410078)参考文献1 Petersen L C, Valentin S, Hedner U. Regulation of the ext rinsic pathway system in healthy and disease: the role of factor a and tissue factor pathway inhibitorJ.Thromb Res, 1995,79:1-41.2朱发明,贺石林,李俊成.组织因子途径生理与临床意义J.国外医学输血与血液 学分册,1997,20(1):52-54.3Eddleston M, De la Torre J C, Old

22、stone M B A, et al. Astrocyte are the primary source of tissue factor in the murine central nervous system. J Clin Invest, 1993,92:349-358.4Hertz L, Juurlink B H J, Hertz E, et al. Preparation of primary cultu res of mouse (Rat) astrocytes. A dissection and tissue culture manual of the ner vous systemM. Alan R, Liss, Inc. 1989.105-1085McGee M P, Foster S, Wang X Y. Simultaneous expression of tissue factor a nd tissue factor pathway inhibitor by human monocytes. A potential