16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程

1、16S1DNA鉴定菌株的标准操作规程1 .适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩 增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信 息。2 .方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴 定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。细菌rRA （核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16s和23S rRNA。 16S rDNA是细菌

2、染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA由于大小 适中，约左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到 其序列，故被细菌学家和分类学家接受。在16SrRNA分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守， 所以可利用恒定区序列设计引物，将16s rDNA片段扩增出来，利用可变区序列 的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信 息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出 细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行1

3、6SrDNA 的全序列扩增和测序，得到较为全面的16S1-DNA的序列信息。由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性， 通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。16SrDNA357F AU15R926F1492R 3对引物正反向测通后，拼接成1500bp左右的16SrDNA序列。3 .设备和材料3.1-3. 2器材移液器(1000口 L、200 uL、lOOuL, 10uL)；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate； 离心机；水浴锅；电泳仪;制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler； 凝胶成像仪：Vers

4、aDoc MP 4000;基因分析仪：AB3500. AB31304. 3试剂DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，lOXTaq Buffer (MgJ), dNTPs, ddH?。等；ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator, 5XSequencing Buffer； BigDye XTerminator Purification Kit；5. 4耗材移液器吸头：lOOOuL、200 uL. 10 uL；离心管：、200 uL； Micro Amp,M Optical 96-Well Reaction Plate； Micro

5、Amp" Optical Adhesive Film；3.5弓1物；扩增长度16SrDNA序列名称正向引物 27F51-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'第 1 部分 、5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3'500 bp 左右反向引物519R正向引物357FCTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3*第 2 部分 、5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3*750bp 左右反向引物1U5R正向引物 926F5'- AAA CTY ?AA KGA ?TT GAC GG-3&

6、#39;第 3 部分 、51-TAC GGC TAC CTT GH ACG ACT T-3r560 bp 左右反向引物1492R其中 M=C：A, Y=C：T. K二G：T, R=A：G, S=G：C. W=A：T； all 1:16. 操作流程核酸提取I.（. 产物纯化测序反应 序列比对7. 实验方法7.1 核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100 uLPrepMan Ultra的离心管中，涡旋震荡混 匀30s左右，然后10（TC水浴lOmin后，以离心机最大转速离心3min,取10uL 上清液与490 uL ddH2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR的模板DMA。提取 的DNA于-2

7、0C保存。5. 2基因扩增5. 2. 1 PCR反应体系试剂使用量（25uL体系）模板DNA2 u L (lOnglOOng)Taq 酶(5U/ u L)uLlOXTaq Buffer(Mg2f)uLdNTPs (各2HL引物F(1 u M)5 HL引物R(1 UM)?5uLddH20uL备注：DNA模板量通常在100 ng以下，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板 使用量。PCR反应体系应在冰中配置，然后置于冰箱中冷却3、5min,最后放于PCR仪上进行 反应，这种冷启动法可增强PCR扩增的特异性。5. 2. 2 PCR反应条件94： lOmin94: 30s58: 30sJ .72:

8、 45s72: 5min4: 85. 2. 3电泳称取1g琼脂糖置于100mL TAE电泳缓冲液中，加热融化，待温度降至60C 左右时，均匀铺板，制成1%的琼脂糖凝胶。PCR反应结束后，加样，以100V电 压进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，染色，用凝胶成像仪观察，拍照，记录实 验结果。5. 3产物纯化5. 3. 1每5 HLpcR产物加入2 HL ExoSAP-IT试剂，混匀。5. 3. 2 <-a放入PCR仪中，37温育15min, 80温育15min。5. 3. 4纯化后的PCR产物做为下一步测序反应的模板。5. 4测序反应5. 4. 1测序反应体系试剂使用量（lOuL体系）模板DN

9、A1 PL(引物(1 PM)pLBigDye Terminator1 uL5XSequencing Buffer1 uLddH20rL5. 4.2S3测序反应条件96： 2min96: 30s55: 15sJ 30Cyc60: 4min4: 85. 4. 4 测序反应纯化(BigDye XTerminator Purification Kit)每管加入 27 u L SAM Solution 和 6 u L BigDye XTerminator Solutiono提高退火温度或采用二温度点法（93C变性，65t左右退火与延伸）。PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量 过

10、多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低, 循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。 减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次 数。用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。模板浓度过高 10ul 体系 lOOngDNA附录（资料性附录）1.细菌16SrDNA三部分的PCR结果电泳图2000bpIOOObn75Obp500bp250bplOObpM： DL2000；1:引物27F和519R的PCR产物（第1部分500bp）2：引物357F和1U5R的PCR产物（第2部分75Obp）3：引物926F和1492R的PCR产物（第3部

11、分56Obp）2.细菌16SrDNA鉴定结果2. 1 16SrDNA前500bp即可反映细菌的种属信息:菌株TL140924的鉴定结果SpecimenLibraryLibrary Entry Name% MatchConsensusLengthLibrary Entry LengthTotal MismatchesTL140924AB_Bacterial5OOLIb_2.2Aeromonas veronll (ATCC=35624 )100.04924910TL140924AB Bacterial5OOLIb.2.2Aeromonas Jandaei (ATCC=49568 )98.94924

12、916TL140924AB Bacterial5 00Lib_2.2Aeromonas veronir (CECTs4199)98.774924917TL140924AB Bacterial5 00Lib_2.2Aeromonas schubertii (ATCC=43700 )98.754924916TL140924AB Bacterial5OOLib_2.2Aeromonas sobrla (ATCCM397997.72492491122. 2 16SrDNA前500bp不足以反映细菌的种属信息:菌株70528的鉴定结果SpecimenLibraryUbrary En(r>>

13、bfame%MatchConsenSUSLengthlibrar y Enlry LengthTotal Mismatch es70528AB_Baclerial500Li)J.2Salmonela enterca enterica* (ATCO13312)99.82457489270520AB_Bacterial500Ub_22Salmonela enterfca entencaA (ATCC=13076)99.82457489270528AB_Bactefial500Li)_22&lmonela enterba enlerica*(ATCC=19430)99.82457489270

14、528AB_Baclefial50QUb-2.2Salmonela erterca enlerica* (ATCC=14028)99.82457 489270528AB.Bacterial500Ub_22Salmonela enterca sslamae* (ATCC=43972)99.8245748922. 3 16SrDNA的全序列信息:菌株70528的鉴定结果SpecmenLixaryLibrary Entry NameUd(CCcnsenSUSLengthbbrar y EntryLengt hToialMsmalc hes70528AB BaderigfullGeneUb 2.0Salmonella entenca enienUis (ATCC=13076)的的14671490170528AB_BactertaMGeneUb_20SaknoneBa entenca typhimunum (ATCO14028)99.7114671489670528AB_BacleriaFullGeneLfc_2.0SaknoneBa enterica erterica (ATCC=13312)曲5314671490870528A