RT-PCR在SARS动物模型鉴定及疫苗评价中的应用

1、RT-PCR在SARS动物模型鉴定及疫苗评价中的应用            【关键词】  RT-PCR      【摘要】 目的 建立RT-PCR方法，用于鉴定SARS感染性动物模型是否成功建立，并对SARS灭活疫苗的效果进行评估。方法 SARS感染动物模型组选用3周岁的健康SPF级恒河猴，经鼻吸入Sino1SARS毒株。病毒攻击后的第7天将动物处死。评价疫苗组选用3周岁的健康SPF级恒河猴，选择Sino3SARS灭

2、活疫苗（20030904批号）肌肉注射，免疫2次。免疫后经鼻滴入Sino1SARS毒株，病毒攻击后的第7天将动物处死。自病毒攻击后的第1天起每日连续采集动物咽拭子标本，病毒攻击后的第3天、第5天、第7天采集血浆标本 1 。将标本进行病毒分离及RT-PCR检测。结果 模型组动物及注射对照疫苗组动物病毒攻击后第17天咽拭子标本经RT-PCR检测均为阳性。注射疫苗组动物仅在病毒攻击后第1天咽拭子标本RT-PCR检测呈阳性。模型组动物血浆标本经RT-PCR检测呈现阳性，疫苗组动物血浆标本经RT-PCR检测均为阴性。病毒分离结果显示在模型动物及注射对照疫苗组动物咽拭子标本中分离到病毒，未在疫苗组动物的咽

3、拭子标本分离到病毒。血浆标本中均未分离到病毒。结论 与病毒分离相比，RT-PCR方法具有快速、简便、特异性强等优点，便于推广使用，可作为模型鉴定、疫苗评估及药物筛选的重要手段。 关键词 SARS实验感染动物模型 RT-PCR nesting PCRApplication of RT-PCR on identifying and evaluating of SARS animal model and vaccine Zhang Yangqing，Tu Xinming，Zhu Hua，et al.Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Acad

4、emy of Medical Sciences，Beijing100021.【Abstract】 Objective Establish the RT-PCR method for verifying the SARS infection animal model and evaluating the effect of vaccine.Methods We choose3years old SPF macaques，and inoculate the SARS corona virus by dropping in nose，those infected animals as SARS mo

5、del and will be used to test SARS candidate vaccine.Collect throat swab specimen and the plasma specimen at different time after monkeys were infected.Results After challenged，by the method of RT-PCR the throat swab specimens from vaccine immunize animal are positive only at the firstday，the plasma

6、specimens from the monkeys of SARS infection animal model are positive，others are negative.We can only isolate virus from the throat swab specimens of SARS infection animal model.Conclusion This method is fast，efficient and special.We can use it in a large scope.It can be used to identify the SARS i

7、nfection animal model and evaluate the efficacy of vaccine.Key words SARS corona virus infected animal model RT-PCR nesting Real-time PCR SARS又称急性重症呼吸系统综合征，临床表现为发热、咳嗽、呼吸窘迫。该疾病传染性强，病死率高，大量病人死于呼吸衰竭，且治愈后出现肺纤维化及股骨头坏死并发症，对人民生命健康造成巨大威胁。因此研究发病机制，降低发病率，减轻疾病症状成为迫在眉睫的事。而SARS疫苗的研制是解决问题最为直接有效的方法。SARS感染性动物模型的建立是

8、进行疾病发生机制的研究、疫苗的评价及药物的筛选的关键环节。如何确认SARS感染性动物模型的成功建立并鉴定模型及评价相应的疫苗是否有效是当前面临的重要问题。目前WHO对SARS患者的标本进行鉴定的方法有病毒分离，ELISA及RT-PCR等。病毒分离耗时长且敏感性较低;ELISA可检测SARS抗原及抗体，但目前缺乏检测SARS病毒的单克隆抗体，无法特异性检测  SARS抗原，而抗体的出现较晚，无法及时判断病原体的入侵;其中RT-PCR的检测方法特异性强，敏感度高且耗时短，为模型的鉴定及疫苗的评价提供了最为直接快速有效的手段 2 。RT-PCR分为荧光PCR 3 及套式PCR等方法 4 。

9、均可在极少的样品中检测到其中的微量病毒。1 材料与方法1.1 实验动物 3岁龄健康恒河猴，购自医科院医学生物学研究所，遗传背景清楚，检查SARS病毒抗体为阴性，并按实验用猴国家标准微生物SPF级别检测排除病原体。共8只，雌雄各半。模型组3只，注射疫苗组4只，注射对照疫苗组1只。1.2 病毒株 SARS病毒（SARS病毒Sino1株，由北京科兴生物制品有限公司提供）。1.3 SARS灭活疫苗 北京科兴生物制品有限公司提供。批号:20030904，含量:10g/ml。制备方法:用SARS病毒（SARS病毒Sino3株，由北京协和医院非典型肺炎患者鼻拭子分离，于Vero细胞传代至第11代）接种Ver

10、o细胞美国ATCC（American Tissue Culture Collection）提供。培养后，用-丙内酯灭活，纯化制成。保存条件:4，溶剂:PBS。1.4 对照疫苗 北京科兴生物制品有限公司提供。批号:20030909，含量:10g/ml。制备方法:按照疫苗生产工艺制备的Vero细胞对照疫苗。保存条件:4。1.5 试剂及仪器 MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit（购自Roche）;One Step RT-PCR Kit（购自TaKaRa）;SARS-CoV核酸扩增荧光检测试剂盒（上海复兴实业医学科技发展有限公司惠赠）;MagNA

11、 Pure LC系统（Roche）;PCR仪（eppendorf5330）;RocheReal-time PCR仪（Lightcycler）。1.6 标本冰箱保存备用。冰箱保存备用。1.7实验设计 （1）将试验用猴随机分组，每组34只动物，模型组不采取任何防护措施，另两组分别注射疫苗，分为SARS灭活疫苗及对照疫苗，然后将动物同时用病毒进行攻击。分别在模型组及疫苗组恒河猴攻击前及病毒攻击后第17天采取咽拭子标本，病毒攻击后第2、第5、第7天采血浆标本。以攻击的毒株作为阳性对照，以未被病毒攻击的空白猴咽拭子及血浆作为阴性对照，并设立未加样品的空白对照，进行nesting-PCR，同时将标本进行病

12、毒分离。（2）将标本提取的核酸同时进行Real-time PCR及nesting-PCR比较其灵敏度。（3）与病毒分离相对比，比较其灵敏度。将原始毒株进行病毒滴定，将病毒分离可检测到的病毒浓度向下稀释，稀释至10 -1 、10 -2 、10 -3 、10 -4 、10 -5 、10 -6 进行RT-PCR，比较两种方法的灵敏度。1.8 实验方法l标本以MagNA Pure LC系统（Roche）自动提取标本中病毒的总核酸。取5l作为模板进行RT-PCR，反应体系如下10×one step RT-PCR buffer5l，MgCl 2 （25mM）10l，dNTP Mixture（10

13、mM）5l，Rnase Inhibitor（40U/l）1l，AMV RTase XL（5U/l）1l，AMV-Optimized Taq（5U/l）1l，1st Primer Pair（20uM）1l，样品RNA1l，加RNAse Free dH 2 O至50l。按以下条件进行RT-PCR反应:5015min，942min，9430s，5530s，7230s，35cycles。引物序列为1st sense:5-ATGAATTACCAAGTCAATGGTTAC-3antisense，5-CATAACCAGTCGGTACAGCTAC-3，2nd sense:5GAAGCTATTCGTCACGTT-3antisense，5CTGTAGA