基因工程的基本操作步骤

1、1 1、基因工程包括哪些步骤？、基因工程包括哪些步骤？3 3、基因工程中的核心环节是哪一步？、基因工程中的核心环节是哪一步？4 4、基因表达载体导入到受体细胞有哪些方法？、基因表达载体导入到受体细胞有哪些方法？5 5、目的基因导入受体细胞就会成功表达吗？、目的基因导入受体细胞就会成功表达吗？ 如何检测和鉴定？如何检测和鉴定？2 2、什么是目的基因？获取的方法有哪些方法？、什么是目的基因？获取的方法有哪些方法？ 思考讨论问题：思考讨论问题：基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取一、目的基因的获取二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建三、将目的基因导入受体细胞三、将目

2、的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定 主要是指主要是指编码蛋白质编码蛋白质的基因的基因( (一）目的基因一）目的基因 目前被广泛提取使用的目的基因有：目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因人胰岛素基因人胰岛素基因等。等。一、目的基因的获取一、目的基因的获取（二）获取目的基因的方法（二）获取目的基因的方法1、从基因文库中直接获取、从基因文库中直接获取2、PCR技术扩增技术扩增3、化学方法直接人工合成、化学方法直接人工合成1 1、从基因文库中直接获取、从基因文库中直接获取（1 1）基因文库的概念）基因文库的概念

3、部分基因文库：部分基因文库： 基因组基因组DNADNA文库：文库： 将含有某种生物将含有某种生物不同不同基因的许多基因的许多DNADNA片断，导入到受体菌片断，导入到受体菌的的群体群体中，中，各个受体菌各个受体菌分别含有这种生物的分别含有这种生物的不同基因不同基因，称为基，称为基因文库因文库含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分基因部分基因，如如:cDNA:cDNA文库文库（2 2）基因文库的建立方法基因文库的建立方法提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA用适当的限制酶酶切用适当的限制酶酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DN

4、ADNA片段与运载体连接片段与运载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库方法一：直接分离法方法一：直接分离法某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA单链互补单链互补DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存与运载体连接与运载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶方法二：反转录法方法二：反转录法-cDNA-cDNA的合成流程图解的合成流程图解PCR扩增仪扩增仪DNADNA半保留复制的基本原理半保留复制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一

5、对引物一对引物热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）模板模板DNADNA2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因原理：原理：前提：前提：条件：条件：利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因5 53 3G GG G T TC C3 35 5 A AG GC CC C5 53 3引物引物G GG G高温高温变性变性低温低温退火退火中温中温延伸延伸1.1.目的基因目的基因DNADNA受热变性，解链；受热变性，解链；5 53 3 A AG G 引物引物2.2.引物与单链互补结合；引物与单链互补结合；3.3.合成链在合成链在DNADNA聚合酶作用下

6、进行延伸。聚合酶作用下进行延伸。、 核心核心二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建功能功能：使目的基因进入使目的基因进入受体细胞并有效表达，受体细胞并有效表达，而且要能稳定存在且遗而且要能稳定存在且遗传给后代。传给后代。启动子启动子 启动子：启动子：位于基因首端一段能与位于基因首端一段能与RNARNA聚合酶聚合酶结合并能结合并能起始起始mRNAmRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。 RNA RNA聚合酶聚合酶: :能够识别能够识别启动子上的结合位点启动子上的结合位点并与其结并与其结合的一种蛋白质合的一种蛋白质. . 终止子：终止子：位于基

7、因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，它片断，它能阻碍能阻碍RNARNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动，并使其从DNADNA模板链上脱离模板链上脱离下来，使转录终止。下来，使转录终止。终止子终止子启动子启动子终止子终止子b b、目的基因、目的基因a a、启动子、启动子c c、终止子、终止子d d、标记基因、标记基因e e、复制原点、复制原点1 1、下列属于获取目的基因的方法的是下列属于获取目的基因的方法的是 利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成 从基因组文库中提取从基因组文库中提取 从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利用D

8、NADNA转录转录 人工合成人工合成 A.A. B. B. C. C. D. D.2 2、19971997年，科学家将动物体内的能年，科学家将动物体内的能够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的DNADNA分子重组，并且在大肠杆菌中表分子重组，并且在大肠杆菌中表达成功。请据右下图回答问题。达成功。请据右下图回答问题。(1)(1)此图表示的是采取此图表示的是采取_合成基合成基因的方法获取因的方法获取_基因的过程。基因的过程。(2) (2) 图中图中DNADNA是以为是以为_ _ 模板，形成单链模板，形成单链DNADNA，在酶的作用下，在酶的作用下合成双链合成双链DNADNA，

9、从而获得了所需要的，从而获得了所需要的目的基因。目的基因。人工人工 目的目的 控制胰岛素合成的信使控制胰岛素合成的信使RNARNA (3) (3) 图中代表图中代表 ，它往往含它往往含 基因，以便对基因，以便对目的基因的检测。目的基因的检测。重组重组DNADNA分子分子 标记标记 将目的基因导入植物细胞的方法将目的基因导入植物细胞的方法1、农杆菌转化法、农杆菌转化法2、基因枪法、基因枪法3、花粉管通道法、花粉管通道法土壤农杆菌转化法示意图土壤农杆菌转化法示意图将目的基因导入动物细胞的方法将目的基因导入动物细胞的方法显微注射法显微注射法将目的基因导入微生物细胞方法将目的基因导入微生物细胞方法宿主

10、细胞（大肠杆菌）宿主细胞（大肠杆菌）感受态细胞感受态细胞（大肠杆菌）（大肠杆菌）Ca2+n首先：首先：n其次：其次：n最后：最后：n还要：还要：要检测转基因生物的要检测转基因生物的DNA上是否插入目的基因上是否插入目的基因DNA分子杂交技术分子杂交技术 分子探针分子探针检测目的基因是否转录出检测目的基因是否转录出mRNA检测目的基因是否翻译出蛋白质检测目的基因是否翻译出蛋白质个体生物学水平的鉴定个体生物学水平的鉴定多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因

11、是否表达（是否表现出入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。变化的个体进一步培养、研究。例：用棉铃饲喂棉例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。抗虫基因并得到表达。3（2010江苏高考，江苏高考，27题，题，8分分）下表中列出了几种限制酶识）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图别

12、序列及其切割位点，图l、图、图2中箭头表示相关限制酶的酶切中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：位点。请回答下列问题：（1）一个图）一个图1所示的质粒分子经所示的质粒分子经Sma 切割前后，分别含有切割前后，分别含有 个游离的磷酸基团。个游离的磷酸基团。0、2 （2）若对图中质粒进行改造，插入的）若对图中质粒进行改造，插入的Sma酶切位点越多，酶切位点越多，质粒的热稳定性越质粒的热稳定性越 。（3）用图中的质粒和外源）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用构建重组质粒，不能使用Sma切割，原因是切割，原因是 。（4）与只使用）与只使用EcoR I相比较，使用相比较，使用BamH 和和Hind 两种两种限制酶同时处理质粒、外源限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防的优点在于可以防止止 。（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入合，并加入 酶。酶。（6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了了 。（7）为了从）为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的