干细胞示踪技术进展

1、吴海东干细胞示踪技术进展大量动物和临床研究均表明干细胞移植确实能改善心、脑和肝等器官功能，干细胞移植治疗器官功能缺损性疾病如缺血性心脏病、心力衰竭 （心衰），脑血管疾病、脑损伤、肝硬化或肝功能衰竭，神经损伤等级已成为21世纪医学的标志性成果。然而， 评价细胞植入、分布、存活、迁移、分化和功能的干细胞标记示踪研究明显滞后于整体功能改善的观察，成为干细胞治疗机制探讨的瓶颈因素和新的研究热点。示踪方法体外示踪（病理学示踪）体内示踪：MR、核素显像、光学成像病理学示踪移植前体外预先标记培养的干细胞，包括荧光染料标记 （标记细胞核或细胞膜） 核素标记方法 Y染色体标记报告基因转染细胞核标记物5-溴-2-

2、脱氧尿嘧啶核苷 （BrdU） 标记DAPI标记Hoechst 染色BrdU标记BrdU是DNA 前体胸腺嘧啶核苷的同类物， 能与内源性胸腺嘧啶竞争性地参与1 期细胞单链DNA合成从而标记细胞核， 细胞核免疫荧光染色后利用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜发射一定波长紫外光激发后观察， 亦可通过免疫组化染色识别BrdU鉴定移植细胞。BrdU标记BrdU标记DAPI标记DAPI荧光染料化学名称为4，6联脒-2-苯基吲哚（46-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride, DAPI）,能与富含A-T碱基对DNA专一结合从而标记细胞核， 紫外光激发下发出浅蓝色荧光。D

3、API标记优点： （1） 荧光保持时间较长、 专一性强、灵敏度高； （2） 标记技术简单， 标记效率高。缺点：细胞分裂将导致DAPI标记强度降低、 灵敏度下降。仅适于短期定量分析。且标记的细胞死亡后可释放出DAPI， 将周围未标记的细胞标记从而产生假阳性。DAPI标记Hoechst染色 Hoechst是能与DNA A-T碱基对特异性结合的双苯并咪唑荧光染料， 细胞核着色， 紫外光激发下发出蓝色荧光。 优点：染色快（13h）， 标记率100%， 可标记成体干细胞， 常用的有Ho33342和Ho33258。存在的问题主要是部分干细胞对该染料拒染。Hoechst染色 细胞膜标记Dil标记：是一种亲脂

4、性碳花青染料， 以类似于磷脂的方式与脂蛋白结合嵌进生物质膜内， 并在膜内做定向扩散运动从而标记整个细胞。其特点是特异性强， 灵敏度高。CM-Dil作为膜标记物存在把标记物转移到未标记细胞的现象，10umol/L标记浓度10d 是安全的， 之后就开始转移到非标记细胞；40umol/L浓度1 周就开始转移， 而且活细胞之间、 活细胞与死细胞之间都有转移现象。因此， CM-Dil比较适合短期的标记示踪。CM-Dil膜标记PKH26、PKH67标记PKH26、PKH67分别是红色、 绿色的亲脂性碳花青荧光染料，与细胞膜的脂质区域能稳定结合，清晰地显现细胞的结构。因荧光染料会随着随干细胞的增生和分化、时

5、间的流失而稀释淬灭，在一定时间将检测不到标记的细胞，PKH26、PKH67被应用于体内外的短期细胞追踪研究PKH26标记荧光染料标记方法优点：化学性结合， 容易操作， 对细胞的增殖和分化基本没有影响。缺点： 1. 随着干细胞的增生和分化而稀释， 随时间的流失而淬灭， 以至于最终完全不能检出， 因而不适合做长时期的体内标记追踪。2.细胞在受体内是否存活难以证明， 因为标记细胞凋亡或死亡后可释放标记物标记周围细胞造成假阳性， 而且被巨噬细胞吞噬后， 细胞碎片在巨噬细胞内也可以有荧光表达。3. 此类荧光标记只能判断细胞的存在， 无法观察细胞形态。核素标记可用于体内外示踪目前常用来示踪标记的核素有3H

6、-、125I-、14C-、99mTc、32P-等， 其中以氚标记脱氧胸腺嘧啶核苷 （3H-TDR） 应用最为广泛， 主要用于检测干细胞的细胞动力学和增殖研究。细胞增殖时需摄取各种嘧啶核苷，3H-TDR作为 DNA补救合成的前体， 可较特异地在 S期掺入细胞 DNA 中。干细胞分裂增殖快，3H-TDR 易被掺入标记。核素标记干细胞移植治疗后在同一张切片上作放射自显影+免疫组化也可观察移植细胞在体内的分布、 迁移情况。核素示踪灵敏度高， 可以稳定长期地示踪。存在的问题是有一定的放射性污染， 检测复杂。Y染色体标记目前国际上比较认可的Y染色体标记细胞追踪移植细胞技术是选用雄性供体和雌性宿主， 利用Y

7、染色体作为标志物。优点：标记技术简单，且标记效率很高， 利用荧光原位杂交（FISH） 技术进行追踪荧光标记的细胞能清楚地观察到， 适合长期体内试验定量分析。存在的问题是不能观察自体细胞移植研究， 且追踪异体移植细胞时需要雄性供体， 雌性宿主， 有较大的局限性。Y染色体报告基因转染利用基因载体将标志基因导入干细胞中， 通过筛选获得表达标志基因的细胞， 然后通过荧光显微镜可直接观察移植细胞在体内的生物学情况， 此类标志基因主要有绿色荧光蛋白 （green fluorescent protein, GFP） 、B-半乳糖苷酶等，以GFP应用最广泛。报告基因转染绿色荧光蛋白聂君，李劲松，王建军，等.

8、大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性和示踪标记J. 中华实验外科杂志,2010,27(10):1432-1435.携带EGFP基因慢病毒载体能高效感染MSCs,EGFP可作为MSCs体内研究的示踪标记.体内跟踪，分子成像技术MRICTNUCLEAR MEDICINE（PET）Ultrasonography (USG) OPTICAL IMAGING分子成像技术自1999 年 Weissleder提出分子影像学概念以来， MRI、核医学成像和光学成像蓬勃发展， 因还未研发针对干细胞特异性或相对特异性标志分子的示踪剂， 核医学成像应用较少。目前在干细胞示踪研究中应用较多的主要是磁标记细胞MRI示踪成像

9、和光学成像， 但光学成像尚处于仅应用于小动物实验性成像阶段。核磁共振成像原理核磁共振成像原理原子核带有正电，许多元素的原子核，如1H、19FT和31P等进行自旋运动。通常情况下，原子核自旋轴的排列是无规律的，但将其置于外加磁场中时，核自旋空间取向从无序向有序过渡。自旋系统的磁化矢量由零逐渐增长，当系统达到平衡时，磁化强度达到稳定值。如果此时核自旋系统受到外界作用，如一定频率的射频激发原子核即可引起共振效应。在射频脉冲停止后，自旋系统已激化的原子核，不能维持这种状态，将回复到磁场中原来的排列状态，同时释放出微弱的能量，成为射电信号，把这许多信号检出，并使之能进行空间分辨，就得到运动中原子核分布图

10、像。原子核从激化的状态回复到平衡排列状态的过程叫弛豫过程。它所需的时间叫弛豫时间。弛豫时间有两种即T1和T2，T1为自旋-点阵或纵向驰豫时间，T2为自旋-自旋或横向弛豫时间。核磁共振成像原理核磁共振成像原理磁共振最常用的核是氢原子核质子（1H），因为它的信号最强，在人体组织内也广泛存在。影响磁共振影像因素包括：(a)质子的密度；(b)弛豫时间长短；(c)血液和脑脊液的流动；(d)顺磁性物质(e)蛋白质。磁共振影像灰阶特点是，磁共振信号愈强，则亮度愈大，磁共振的信号弱，则亮度也小，从白色、灰色到黑色。各种组织磁共振影像灰阶特点如下；脂肪组织，松质骨呈白色；脑脊髓、骨髓呈白灰色；内脏、肌肉呈灰白色

11、；液体，正常速度血液呈黑色；骨皮质、气体、含气肺呈黑色。核磁共振的另一特点是流动液体不产生信号称为流动效应或流动空白效应。因此血管是灰白色管状结构，而血液为无信号的黑色。这样使血管很容易软组织分开。正常脊髓周围有脑脊液包围，脑脊液为黑色的，并有白色的硬膜为脂肪所衬托，使脊髓显示为白色的强信号结构。核磁共振已应用于全身各系统的成像诊断。效果最佳的是颅脑，及其脊髓、心脏大血管、关节骨骼、软组织及盆腔等。对心血管疾病不但可以观察各腔室、大血管及瓣膜的解剖变化，而且可作心室分析，进行定性及半定量的诊断，可作多个切面图，空间分辨率高，显示心脏及病变全貌，及其与周围结构的关系，优于其他X线成像、二维超声、

12、核素及CT检查。在对脑脊髓病变诊断时，可作冠状、矢状及横断面像。MRI活体示踪磁标记细胞MRI活体示踪移植干细胞前提是需用MR对比剂磁化标记细胞， 以使能与宿主细胞相区分。MR对比剂1.主要产生T1正性对比效应的Gd3+，检测阀值过高，实用价值不大。2. T2 负性对比效应，但对 T1 弛豫的加快作用较弱：通过葡聚糖生物高分子包裹 Fe3O4 晶体形成核壳式结构的超顺磁性氧化铁 （Superparamagnetic iron oxide，SPIO）纳米材料(Feridex）。3. 氯化锰：有一定的细胞毒性。标记方法简单，有独特的成像功能。 钆-荧光双标记及MRI体外示踪钆-荧光双标记及MRI体

13、外示踪沈君，周翠屏，成丽娜，等. 大鼠骨髓间充质干细胞的钆-荧光双标记及MRI体外示踪的研究J. 中华放射学杂志,2008,42(4):426-431.磁标记细胞MR成像原理具有超顺铁磁性的Fe3O4晶体低浓度即能显著地造成局部磁场的不均匀， 使邻近氢质子在弛豫中很快产生相散， 加速了质子去相位过程， 缩短了组织的T2值， 在梯度回波和自旋回波序列MRI中， 使组织信号降低从而产生较强的T2 负性对比效应， 常规1.5T MR成像就能显示被标记的干细胞， 但SPIO对 T1 弛豫的加快作用较弱。SPIO在体内可生物降解被细胞代谢， 示踪细胞至少可达 3个月， 假阳性低。因此，MRI示踪磁标记细

14、胞是活体内最理想的细胞示踪方法。磁共振示踪突出的优势极佳的空间分辨力,扫描能明确部位，实时显像并连续跟踪标记的细胞。能用于导向治疗和跟踪。检测细胞阈值远低于有效治疗剂量。磁共振细胞示踪时间不仅与细胞转归相关， 还与细胞内铁含量、 局部注射细胞量、 磁共振仪器分辨力、 成像条件调节有关。MRI示踪存在的问题示踪存在的问题尚无磁共振示踪应用于人类临床试验的报道原因：原因： （1）安全性有待进一步研究安全性有待进一步研究： 虽然大部分研究表明顺磁性铁标记后不影响干细胞的活性、 增殖和向其他细胞的分化能力， 但也有作者报道标记后的骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化能力受损。（2）灵敏度相对不足（3）非特

15、异性显像：标记干细胞在体内死亡、 裂解， 释放出的氧化铁颗粒能否造成非特异性显像尚无定论。不能长期示踪由于氧化铁不能够跟随细胞的分裂而自体复制， 所以在监测移植后干细胞的增殖和分化方面存在一定不足。本科的研究结果朱文珍，李祥，漆剑频，等. 以超顺磁性氧化铁标记的神经干细胞移植后的磁共振成像示踪研究J. 中华器官移植杂志,2007,28(5):299-302.Modo M, Mellodew K, Cash D, et al. Mapping transplanted stem cell migration after a stroke: a serial, in vivo magnetic r

16、esonance imaging studyJ. NeuroImage,2004,21(1):311-317.黄浙勇，葛均波，杨姗，等. 超顺磁性氧化铁标记间充质干细胞心肌移植的磁共振成像研究J. 中华心血管病杂志,2007,35(4):344-349.黄浙勇，葛均波，杨姗，等. 超顺磁性氧化铁标记间充质干细胞心肌移植的磁共振成像研究J. 中华心血管病杂志,2007,35(4):344-349.MRI示踪细胞的敏感性不够理想，心肌内局部注射的显像阀值为1*105。局部移植迁移量有限，如何才能敏感的反映出少量细胞的活动？ 黄浙勇，葛均波，杨姗，等. 超顺磁性氧化铁标记间充质干细胞心肌移植的磁共振

17、成像研究J. 中华心血管病杂志,2007,35(4):344-349.fluorescent-magnetite-nanocluster(FMNC)增强敏感性的方法纳米材料包裹法增强敏感性的方法纳米材料包裹法FMNC跟踪时间短细胞自健侧向受损区迁移柠檬酸盐包裹的SPION锰离子增强磁共振成像Mn2+作为强顺磁性钙离子竞争剂,可以通过钙离子通道进入神经细胞,并可通过轴突、突触运输,减少含Mn2+组织的T1值,从而增强区域T1加权MRI信号.目前,MEMRI主要用于三方面的研究:活动诱导观察脑的功能活动,在体、动态地追踪神经传导通路,并可以精细观察脑部形态学.MEMRI在多领域的研究结果表明它是探

18、测生物体内的分子过程和大脑功能活动的重要工具和手段.锰亦可作为干细胞体内移植的示踪剂，但目前研究较少，而且锰有一定的毒性，合适的浓度和剂量须待进一步研究。放射性核素显像示踪放射性核素显像示踪在心脏细胞移植中的应用： 核素标记的优点是背景信号低， 信噪比较高， 能检测经血管注射后向缺血心肌归巢的少量干细胞。用于标记心脏治疗细胞的核素有111铟（111In）、锝依莎美肟 （99mTc-HMPAO）、 18氟-脱氧葡萄糖 （18F-FDG）等。单光子发射计算体层摄影（SPECT）可示踪细胞一直到注射后 3 天， 但临床磁共振机未能对 Feridex标记干细胞显像。说明静脉注射后真正分布到心脏的标记细

19、胞数量有限， 磁共振成像敏感性不如核素显像。目前存在的问题 核素标记也可能对治疗细胞有放射性损害， 甚至有癌变的潜在危险。损害的大小与放射性元素的物理学特性和特定细胞的易感性有关。核素半衰期短（18F-FDG 110 min）， 损害小， 但成像观察时间也相应缩短。111In半衰期较长 （67 h） 加上射线短， 已有报道损害造血干细胞的增殖分化， 但对内皮祖细胞似乎没影响。放射性核素显像示踪和磁共振示踪相反， 放射性核素显像灵敏度较高， 能检测标记细胞的生物学分布， 包括外周血管注射后归巢到心肌的细胞百分比， 但观察时间受核素衰减的制约， 且空间分辨力低。存在非特异性显像： 成像信号与细胞存

20、活并不直接相关， 各种原因引起的核素标记物从细胞释放将导致非特异性信号的产生， 甚至在细胞死亡后仍有可能观察到成像信号。其次， 细胞分裂对影像学的影响也尚未明了。报告基因显像原理：在体外用各种载体技术将报告基因转移入待移植细胞， 检测报告基因的表达率后注入体内，通过静脉注射特异性核素标记的报告探针便可检测出表达报告基因的移植细胞。优点：由于报告探针的积聚依赖于报告基因的表达以及表达产物的活性， 因此信号强度与治疗细胞的活性相关， 这种特异性检测能力是直接标记不可比拟的。况且， 检测不受时间的限制， 可反复进行， 而直接标记存在核素衰减、 铁制剂释放导致示踪周期短的缺陷。报告基因最大的挑战是如何保证影像信